納升液相系統(tǒng)因具有非常高的靈敏度，常用于蛋白質(zhì)組學工作流程中，特別是當可用樣品量非常低的時候。高質(zhì)量的色譜分離對于蛋白質(zhì)鑒定很重要，因為良好的峰形和分離可以減少離子抑制，并允許質(zhì)譜系統(tǒng)采樣盡可能多的特異性肽段。
在本研究中，我們結(jié)合使用納升液相系統(tǒng)與Zeno SWATH DIA流程，以評估ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)使用納升系統(tǒng)時蛋白鑒定和定量的能力。
?液相方法：液相系統(tǒng)：NanoLC 425系統(tǒng)(SCIEX)，色譜柱：核殼Biozen 5 μm Peptide XB-C18 (0.075 x 500 mm, 5 μm, P/N 00j -4792- w - sx)，流速：400 nL/min，梯度：60min。
?質(zhì)譜方法：質(zhì)譜：ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)，離子源：OptiFlow Turbo V離子源，采集模式：Zeno SWATH DIA，可變窗口數(shù)：100個，累積時間：25毫秒，二級MS/MS模式下啟用Zeno Trap（Zeno阱），樣品采集三份平行數(shù)據(jù)。
?數(shù)據(jù)分析：Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA- NN軟件處理，分別使用自建庫和非自建庫流程，數(shù)據(jù)庫為之前由OneOmics生成的人細胞裂解液數(shù)據(jù)庫。
主要結(jié)果：
1.不同進樣量時蛋白質(zhì)鑒定和定量測試
我們使用K562細胞裂解液樣品，在1小時的液相梯度中，使用Zeno SWATH DIA采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在DIA-NN中采用自建庫分析，發(fā)現(xiàn)隨著上樣量的增加，蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)也增加了（圖1）。在三次重復實驗中，確定FDR <1%，CV <20%的定量蛋白質(zhì)數(shù)量。當柱上進樣200 ng樣品時，鑒定蛋白質(zhì)約6800個，可定量蛋白質(zhì)約6300個(92%)。
圖1. 不同進樣量時蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量
對比不同進樣量時定量到的FDR <1%，CV <20%肽段，可以看到隨著進樣量增加，60min納升流速梯度中鑒定（空心標志）和定量（實心標志）的肽段數(shù)量也在增加（圖2）。在100 ng進樣量時，約67,000個肽段被鑒定到，其中約80%被定量到。
圖2. 不同進樣量時肽段鑒定和定量數(shù)量
2.數(shù)據(jù)分析時使用自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫對比
我們使用DIA-NN軟件對比了相同Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)在使用自建數(shù)據(jù)庫和不使用自建庫時，蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量的區(qū)別。自建數(shù)據(jù)庫方法中使用的數(shù)據(jù)庫為之前通過DDA鑒定建立的人細胞裂解液數(shù)據(jù)庫；非自建庫方法中使用的為從人FASTA文件中生成的理論數(shù)據(jù)庫。在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定和定量中，兩個方法所得到的結(jié)果非常相似。此外，使用另外一個理論公共數(shù)據(jù)庫Pan human數(shù)據(jù)庫時，Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)也能得到類似的結(jié)果（圖3左上及右上）。
為了進一步測試非自建庫方法的保真度，對使用理論數(shù)據(jù)庫與DDA自建庫中分別鑒定到的蛋白質(zhì)進行對比。維恩圖(圖3，下)顯示，這些方法可以得到非常接近的結(jié)果，這進一步表明使用理論數(shù)據(jù)庫也可以得到很好的蛋白質(zhì)鑒定和定量分析結(jié)果，將給Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)分析帶來很大的便利。
圖3. 對比三種不同數(shù)據(jù)庫處理數(shù)據(jù)時的蛋白鑒定結(jié)果
圖3說明：3個不同的數(shù)據(jù)庫（Lib Free，使用在FASTA文件的理論庫；PHL，Pan human公共數(shù)據(jù)庫；ZT Lib，根據(jù)Zeno DDA建立的數(shù)據(jù)庫）。上圖為FDR <1%（柱狀圖透明部分）和CV <20%（柱狀圖實心部分）時蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量，下圖為使用非自建數(shù)據(jù)庫方法或自建庫方法中鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)量對比，二者重合度很高。
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