細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)意義及應(yīng)用

細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長增殖等。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起核心作用，現(xiàn)代的生物技術(shù)一般包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

01、基礎(chǔ)研究

如藥物作用機(jī)理、基因功能、疾病發(fā)生機(jī)理等研究

02、藥物研究開發(fā)

如新藥篩選、疫苗、基因工程藥物，細(xì)胞工程藥物，研究與開發(fā)，單克隆抗體制備等

03、疫苗生產(chǎn)

如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、多肽疫苗（腫瘤疫苗）等

04、基因工程藥物生產(chǎn)

如EPO等，抗體藥物、基因治療藥物生產(chǎn)

05、細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)

生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽、生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等，預(yù)測其在體內(nèi)的藥效和替代體內(nèi)法檢測其成品的生物活性

HEK293懸浮培養(yǎng)，力康設(shè)備解決方案為參考

今天，采用力康相關(guān)設(shè)備的解決方案作為參考，以“二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行HEK293懸浮培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)流程”為例，小編為大家奉上一篇干貨滿滿的細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)盛宴。

此類哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基成本較高、生長條件較為復(fù)雜、生長周期較長、對剪切力和培養(yǎng)環(huán)境較為敏感，是較為典型的高要求細(xì)胞培養(yǎng)案例。

細(xì)胞培養(yǎng)可分為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)、微生物細(xì)胞培養(yǎng)，其中，最困難的是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所要求的體外培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)條件較高，因此，對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的要求也較高。

用于細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)設(shè)備很多，比如：生物安全柜、超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、醫(yī)用低溫保存箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、二氧化碳恒溫振蕩器、生物反應(yīng)器、超純水系統(tǒng)等，這些設(shè)備的品質(zhì)在某種程度上決定了細(xì)胞培養(yǎng)的效果。

實(shí)驗(yàn)流程（僅供參考）

一、細(xì)胞馴化

（1）直接馴化：大部分情況下，培養(yǎng)于原培養(yǎng)基中的細(xì)胞，可以直接適應(yīng)目標(biāo)培養(yǎng)基，只要按照日常傳代方式（稀釋）更換培養(yǎng)基即可。

1、原培養(yǎng)基中的細(xì)胞，直接稀釋傳代到目標(biāo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml

2、將細(xì)胞置于37℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)

3、4~6天后對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋（或者離心800rpm，3~5min更換上清），保持稀釋（或者離心）后細(xì)胞密度為0.3~0.4×106cells/ml

4、經(jīng)過在100%的目標(biāo)培養(yǎng)基中的幾次傳代培養(yǎng)，傳代后4~6天細(xì)胞的密度可以達(dá)到2~3×106cells/ml，細(xì)胞活率＞90%。這說明細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了目標(biāo)培養(yǎng)基，之后進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml左右

（2）漸進(jìn)式馴化：注意：選用低代次，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行馴化。

1、原培養(yǎng)基中復(fù)蘇細(xì)胞并繼續(xù)使用該培養(yǎng)基傳代2~3次至細(xì)胞生長穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2~3×106cells/ml后進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞密度控制在0.5~0.6×106cells/ml，5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基的比例為75:25

2、將細(xì)胞置于37℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)

3、當(dāng)細(xì)胞密度3~4天后達(dá)到3×106cells/ml且細(xì)胞活率>90%，傳代時(shí)5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基的比例為 50:50,細(xì)胞密度控制0.5~0.6×106cells/ml

注：如細(xì)胞生長慢，可離心上清，留20%培養(yǎng)基，加入80%的5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基比例為75:25的混合培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；再下次傳代時(shí)重復(fù)步驟③

4、重復(fù)步驟③逐步增加目標(biāo)培養(yǎng)基所占的比例（5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基的比例為25:75至10:90）直到100%的目標(biāo)培養(yǎng)基

5、經(jīng)過在100%的目標(biāo)培養(yǎng)基中的幾次傳代培養(yǎng)，傳代后3~4天細(xì)胞的密度可以達(dá)到2~3×106cells/ml，細(xì)胞活率＞90%，這說明細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了目標(biāo)培養(yǎng)基。之后進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml，一般傳代2~3次后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。注意：一般細(xì)胞馴化過程中，前三代細(xì)胞的狀態(tài)可能不是很好，但一般從第四代狀態(tài)會(huì)有改善

二、細(xì)胞復(fù)蘇

1、迅速取出凍存的細(xì)胞，在37℃水浴條件下進(jìn)行解凍（可以將離心管在水中輕輕晃動(dòng)，時(shí)間控 制在60s以內(nèi)）

2、輕輕地混勻細(xì)胞并將融化的細(xì)胞全部移至 15ml（或 50ml）無菌離心管中（用培養(yǎng)基沖洗幾次凍存管），逐滴加入5~8ml預(yù)熱到37℃的目標(biāo)培養(yǎng)基

3、離心換液（800rpm，3~5min）去除全部上清，加入預(yù)熱新鮮目標(biāo)培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至125ml搖瓶內(nèi)（用培養(yǎng)基沖洗幾次離心管），最終達(dá)到25~40ml，使得細(xì)胞密度達(dá)到0.4~0.6×106cells/ml

4、將細(xì)胞置于37℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)

5、2~3天后通過人工或儀器測定細(xì)胞的密度及活率，若細(xì)胞密度達(dá)到2.0×106cells/ml，活率達(dá)到85%以上則可進(jìn)行傳代培養(yǎng)

6、如果細(xì)胞密度低于1.0×106cells/ml，則建議對細(xì)胞進(jìn)行離心（800rpm，5min），然后重懸于20~30ml的新鮮培養(yǎng)基中使得細(xì)胞密度為0.4~0.6×106cells/ml左右，并繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞正常生長則可進(jìn)行傳代培養(yǎng)

三、細(xì)胞傳代

1、取細(xì)胞培養(yǎng)樣品，人工或儀器測定細(xì)胞密度以及活率

2、原培養(yǎng)基中的細(xì)胞，直接稀釋傳代到目標(biāo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml

3、恢復(fù)活力的標(biāo)準(zhǔn)：活率＞95%，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則圓整，生長倍增時(shí)間正常

4、將細(xì)胞置于37℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)，2~3天傳代一次

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染在目標(biāo)培養(yǎng)基中，采用商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑（例如Gibco293Fectin™、ExpiFectamine™293、TransfectionKit）或PEI（線性化聚乙酰亞胺），可以實(shí)現(xiàn)對 HEK293 細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，具體操作可參考所購買轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1、轉(zhuǎn)染前一天按照2.0×106cells/ml密度接種，培養(yǎng)第二天細(xì)胞密度可至4.0×106cells/ml左右

2、培養(yǎng)第二天，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，細(xì)胞活率＞95%，活細(xì)胞密度≥4.0×106cells/ml，可直接使用；若細(xì)胞密度低于4.0×106cells/ml，可通過離心（800rpm，3~5min）收集細(xì)胞，將細(xì)胞以 4.0×106cells/ml密度重懸于目標(biāo)培養(yǎng)基中 注：如果后期進(jìn)行≥6天的瞬轉(zhuǎn)表達(dá)同時(shí)不添加補(bǔ)料和葡萄糖，建議瞬轉(zhuǎn)時(shí)密度控制在 2.0~3.0×106cells/ml

3、按照優(yōu)化后的瞬轉(zhuǎn)工藝，以20ml體系單抗使用PEI轉(zhuǎn)染為例，制備DNA和PEI混合液

①配制A、B液，渦旋混勻后室溫靜止5min

②A：20ug質(zhì)粒+600ul（培養(yǎng)基或PBS）

③B：80ugPEI+600ul（培養(yǎng)基或PBS），進(jìn)行0.22um抽濾

④將A液加入到B液中輕輕吹打混勻，室溫靜置15min

4、將混合液加入到培養(yǎng)液中，進(jìn)行培養(yǎng)

5、大于6天的培養(yǎng)時(shí)間，建議在20小時(shí)后加≤5%補(bǔ)料（也可再額外加入＜5g/l葡萄糖）加入培養(yǎng)基，可進(jìn)一步提高活細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量。如果條件允許，可以檢測殘?zhí)牵刂茪執(zhí)菨舛仍?~6g/l，效果更佳

6、培養(yǎng)至活力低于60%，結(jié)束培養(yǎng)。此步驟可以直接轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，也可得到腺病毒（lentivirus表達(dá)系統(tǒng)）再進(jìn)行病毒感染表達(dá)蛋白

五、細(xì)胞感染

1、按一定比例混合病毒和293細(xì)胞，進(jìn)行感染

2、將細(xì)胞放置在37℃溫度，5%CO2濃度，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)

六、細(xì)胞凍存

1、凍存細(xì)胞時(shí)，要選擇處于對數(shù)生長期同期細(xì)胞在90%以上的細(xì)胞活率，一般建議凍存密度為 5~10×106cells/ml

2、事先計(jì)算好凍存的細(xì)胞管數(shù)和所用的培養(yǎng)基的體積

3、制備細(xì)胞凍存液：90%目標(biāo)培養(yǎng)基+10%DMSO混合液存放在4℃，一般為當(dāng)天用當(dāng)天制備

4、對細(xì)胞樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)

5、以800rpm，3~5min的條件離心收集細(xì)胞，然后用凍存培養(yǎng)基（4℃）重懸細(xì)胞

6、取樣計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，使得細(xì)胞密度為 5~10×106cells/ml，迅速分裝細(xì)胞到無菌的凍存管中，一般2ml的凍存管加入1~1.5ml細(xì)胞懸液，貼好標(biāo)簽，密封

7、將細(xì)胞凍存管放到程序降溫凍存盒（注意填充異丙醇，4℃預(yù)冷）中，置于-80℃冰箱（每分鐘下降1℃），過夜存放后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中進(jìn)行保存。（注意：降溫一定需要梯度降溫：可4℃1h、-20℃2~4h，-80℃過夜，最后放入液氮長期儲(chǔ)存。）

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，力康實(shí)驗(yàn)室相關(guān)設(shè)備

Smart Plus 超純水系統(tǒng)

在上述實(shí)驗(yàn)流程中，細(xì)胞培養(yǎng)基干粉調(diào)制制備、細(xì)胞馴化過程中細(xì)胞培養(yǎng)液的稀釋、細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中轉(zhuǎn)染試劑的制備等步驟，均需使用純水或超純水，在實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)常被忽略的蒸發(fā)盤、水庫、水盤，用來維持培養(yǎng)環(huán)境中的濕度，如果使用的純水或超純水不達(dá)標(biāo)或蒸發(fā)盤、水庫、水盤長期沒有清洗，水中的雜質(zhì)可能會(huì)擴(kuò)散到培養(yǎng)環(huán)境中，從而影響細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果。所以，實(shí)驗(yàn)室純水和超純水系統(tǒng)的選擇尤為重要。

力康Smart Plus超純水系統(tǒng)為您的實(shí)驗(yàn)提供滿足《GB/T 33087-2016 儀器分析用高純水規(guī)格及試驗(yàn)方法》、《GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法》、《GB/T 11446電子級(jí)超純水中國國家標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)的純水或超純水，助力您的實(shí)驗(yàn)研究取得圓滿成功。

高速冷凍離心機(jī)

在上述實(shí)驗(yàn)流程中，細(xì)胞馴化、復(fù)蘇、轉(zhuǎn)染、凍存、細(xì)胞培養(yǎng)液的離心，均需使用高速冷凍離心機(jī)。如果細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的目的是產(chǎn)物表達(dá)，那么對溫度敏感性的產(chǎn)物，例如在低溫條件下才能保持活性的蛋白質(zhì)，離心過程中必須使用冷凍離心機(jī)，從而保障在實(shí)驗(yàn)步驟中，維持產(chǎn)物的活性，獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

力康高速冷凍離心機(jī)，為您提供穩(wěn)定的運(yùn)行工況、智能升降溫控制、智能轉(zhuǎn)子識(shí)別技術(shù)、電子式平衡裝置，可滿足細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)需求。其出色的產(chǎn)品功能為您節(jié)省寶貴的時(shí)間，保護(hù)您珍貴的實(shí)驗(yàn)樣品，助您盡快獲得研究成果。

醫(yī)用低溫保存箱

在上述實(shí)驗(yàn)流程中，在細(xì)胞凍存過程中，需使用醫(yī)用低溫保存箱，保存箱的穩(wěn)定性較為重要，如果出現(xiàn)局部失溫或溫度異常，以及凍存操作不標(biāo)準(zhǔn)或系統(tǒng)故障，珍貴的細(xì)胞種子樣本極有可能失活。

力康低溫冷鏈產(chǎn)品涵蓋2-8℃冷藏保存箱、-25℃低溫保存箱、-40℃低溫保存箱和-86℃低溫保存箱，擁有多種容積規(guī)格可選，雙機(jī)復(fù)疊制冷，智能觸屏操作、可選雙獨(dú)立系統(tǒng)主機(jī)、多重報(bào)警系統(tǒng)、采用第二代VIP技術(shù)、采用*低噪音技術(shù)等特點(diǎn)，產(chǎn)品可用于保存病毒、細(xì)菌樣本、疫苗、生物組織及器官特殊食品、藥品、材料等，為您的實(shí)驗(yàn)室研究提供穩(wěn)定、理想的儲(chǔ)存環(huán)境。

力康集團(tuán)深耕醫(yī)療器械和生命科學(xué)領(lǐng)域三十余年，專注于提供多樣化、多場景的臨床醫(yī)療和實(shí)驗(yàn)室整體解決方案，包括智慧數(shù)字一體化手術(shù)室、數(shù)字化麻醉重癥、數(shù)字化實(shí)驗(yàn)室、數(shù)字化新生兒科、數(shù)字化康復(fù)中心、數(shù)字化醫(yī)療及實(shí)驗(yàn)室信息管理以及數(shù)字化遠(yuǎn)程醫(yī)療整體解決方案等。

未來，力康將繼續(xù)為用戶提供智能化、數(shù)字化、 人性化的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，滿足現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用需求，提供各類解決方案和專業(yè)化服務(wù)。