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石蠟切片免疫組化染色實驗操作步驟
閱讀：1581 發(fā)布時間：2021-1-181.石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應(yīng)置 60℃ 1 小時） 。
① 二甲苯 、II，各 10 分鐘。
② 梯度酒精：100%，2 分鐘 95%，2 分鐘 80%，2 分鐘 70% 2 分鐘。
③ 蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床）。
2.過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2 O2 ，室溫 10 分鐘（避光） 。
3.蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
4.抗原修復(fù)：根據(jù)待檢測的抗原，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/span>
附：抗原修復(fù)液（10mMpH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液）的配制：① 儲備液的配制：A 液：枸櫞酸三鈉- 2H2O 29.41g + 蒸餾水 1000ml；B 液：枸櫞酸 21g + 蒸餾水 1000ml；② 工作液的配制：A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸餾水 900ml
抗原修復(fù)的方法：
① 高壓鍋處理技術(shù)：枸櫞酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0），淹沒切片，蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸，上汽 3 分鐘后緩慢冷卻（可用自來水在高 壓鍋外沖，以助冷卻） 。
② 微波處理技術(shù)：用塑料切片架，置于塑料或耐溫玻璃容器內(nèi)，枸櫞酸 鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或高檔,5 分鐘;取出并補充已預(yù)熱的 枸櫞酸鈉緩沖液； 再選擇中高或高檔，5分鐘（.*佳溫度為 92 95℃）
③ 酶消化處理。
抗原修復(fù)的注意事項：① 組織不能干。 ② 選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。 ③ 該方法主要用于 10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。④ 抗原修復(fù)后至 DAB 顯色的過程中，均需用 PBS 緩沖液。
5.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
6.正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤狀態(tài),）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動物血清）處理，37℃，15 分鐘。
附：正常血清配制 ( 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl (10%拋灑量) 計算。
7.滴加抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加抗體，37℃ 2 小時（也可置于 4℃冰箱過夜） 。
8.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
9.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。
10．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
11．滴加三抗 （SAB 復(fù)合物） ，37℃，40 分鐘。
12．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
13．DAB 顯色，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止） 。
附：DAB 的配制① 儲備液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μ l 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl
14．自來水（細(xì)水）充分沖洗。
15．蘇木素復(fù)染，室溫，30 秒，自來水沖洗。
16．自來水沖洗返藍(lán)，15 分鐘。
17．梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%，2 次，5 分鐘。
18．二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘。
19．封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。