Ｒunx3 對尋常性銀屑病患者 Th17 / Treg 細胞分化的影響及其作用機制
付丹丹1 ，宋向鳳2 ，李占國1 ，李敏1 ，劉冬1 ，夏永華1 ，田中偉1

［摘    要］   目的    探討 Ｒunx3 對銀屑病患者 Th17，Treg 細胞分化的影響及作用機制。方法    收集 58 例銀屑病患者和 50 例健康對照者血液樣本，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血 CD4 + T 細胞，qＲT-PCＲ 檢測 Ｒunx3的 mＲNA 水平; 采用 ＲNA 干擾法下調(diào) Ｒunx3 的表達水平，流式細胞儀檢測 Th17 和 Treg 細胞水平; ELISA 法測定外周血 IL-17，IL-23，TGF-β，IL-10 含量; 實時定量  PCＲ 法檢測 ＲOＲγt，F(xiàn)oxp3 的 mＲNA 水平。結(jié)果    與對照組相比，銀屑病患者外周血 CD4 + T 細胞中 Ｒunx3 的表達明顯升高。Ｒunx3-siＲNA轉(zhuǎn)染后，Th17 / Treg 細胞比值降低，同時伴隨有 Th17 型炎性因子 IL-17，IL-23 表達下降以及 Treg 型抗炎因子 TGF-β，IL-10 的上調(diào)。機制分析證實，Ｒunx3 沉默后，細胞中 Th17 轉(zhuǎn)錄因子 ＲOＲγt 明顯下降，而 Treg 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Foxp3 水平增加。結(jié)論    Ｒunx3 可通過ＲOＲγt，F(xiàn)oxp3 調(diào)控CD4 + T 細胞向Th17，Treg型細胞的分化，影響銀屑病患者 Th17 / Treg 比例的失衡，提示其可作為銀屑病防治的新方向。

［關(guān)鍵詞］ 銀屑病; Ｒunx3; CD4 + T 細胞; Th17 / Treg; 轉(zhuǎn)錄因子
［中圖分類號］ Ｒ 758． 63 ［文獻標識碼］   A ［文章編號］   1001 － 7089( 2015) 11 － 1107 － 05
［DOI］   10. 13735 / j. cjdv. 1001-7089. 201505066
Effect of Ｒunx3 on Th17 / Treg Cells Differentiation in Psoriasis and the Underlying Mechanism
FU Dan-dan1 ，SONG Xiang-feng2 ，LI Zhan-guo1 ，LI Min1 ，LIU Dong1 ，XIA Yong-hua1 ，TIAN Zhong-wei1
( 1. Department  of   Dermatology，the  First   Affiliated  Hospital   of   Xinxiang  Medical   University， Weihui  453100，China;
2. Immunology Department of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China)
［Corresponding author］     TIAN Zhong-wei ，E-mail: zhonwt@ 163. com
［Abstract］   Objective    To investigate the function and the underlying mechanism of Ｒunx3 on Th17 and Treg cells dif- ferentiate in psoriasis. Methods    Fifty eight patients with psoriasis vulgaris and 50 healthy controls were en- rolled in our study and their peripheral blood samples were obtained. CD4 + T cells in the peripheral blood samples were isolated by density gradient centrifugation. The mＲNA levels of Ｒunx3 in CD4 + T cells were an- alyzed by qＲT-PCＲ. After silencing the expression of Ｒunx3 by its specific siＲNA，flow cytometry was per- formed to determine the percentage of Th17 and Treg cell. The secretions of IL-17，IL-23，TGF-β，IL-10 were analyzed by ELISA. Furthermore，the mＲNA levels of ＲOＲγt，F(xiàn)oxp3 were determined by qＲT-PCＲ. Ｒesults The expressions of Ｒunx3 in peripheral blood CD4 + T cells were significantly increased in patients with psoriasis compared with the control groups. Additionally，Ｒunx3 knockdown significantly decreased the ratio of Th17 / Treg cells． Furthermore，Ｒunx3 knockdown down-regulated the expression of IL-17 and IL-23，but up-regulated TGF-β  and IL-10 expression. The mechanism investigation revealed that Ｒunnx3 knockdown significantly inhibited the expression of Th17-specific transcription factor ＲOＲγt，while promoted the level of Treg-specific transcription factor Foxp3. Conclusion     Ｒunx3 may affect the imbalance of Th17 / Treg levels in patients with psoriasis by regulating their specific transcription factor ＲOＲγt and Foxp3，suggesting a po-
tential target for prevention and treatment of psoriasis.
［Key words］     Ｒunx3;  CD4 + T cells;  Th17 / Treg;  Transcription factor
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［基金項目］  1. 河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目( 13A320852) ; 2. 新鄉(xiāng)市重點科技攻關(guān)計劃項目( ZG13022) ; 3. 河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程( 201004159)
［作者單位］ 1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚性病科，河南 衛(wèi)輝 453100; 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453000
［通訊作者］   田中偉，E-mail: zhonwt@ 163. com
［網(wǎng)絡(luò)出版時間］   2015-10-08 14∶ 44  ［網(wǎng)絡(luò)出版地址］   http:  / / www． cnki． net / kcms / detail /61． 1197． Ｒ． 20151008． 14∶ 44． 006． html
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中國皮膚性病學(xué)雜志 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期 Chin J Derm Venereol，Nov. 2015，Vol. 29，




銀屑病( psoriasis) 是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的免疫異常的炎癥性皮膚病，其 發(fā)病機制依舊是國內(nèi)外的研究熱點。CD4 + T 淋巴細胞在不同的條件下可分化成不同亞型的 T 淋巴細胞， 包括 Th1 型、Th2 型、Th17 型效應(yīng)細胞及調(diào)節(jié)性 T 細胞(  regulatory T cell，Treg ) ，執(zhí)行不同的生物學(xué)功能［1］。其中，Th17 和 Treg 細胞在自身免疫性疾病、感 染性疾病和腫瘤等病理過程中發(fā)揮重要作用［2］。近  年來的研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者體內(nèi)  Th17 細胞異?；罨?Treg 細胞的增殖及功能不足，表明 Th17 / Treg 細胞的失衡有可能參與了銀屑病的病理進程［3］，提示恢 復(fù)銀屑病患者體內(nèi)的 Th17 / Treg 平衡將成為該病防治的重要方向。Th17 和 Treg 的分化分別受轉(zhuǎn)錄因子ＲOＲγ 和 Foxp3 的調(diào)控 ［4-5］。
Ｒunt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 3 ( runt-related transcription factor 3，Ｒunx3) 是一種腫瘤抑制基因，廣泛表達于骨髓、脾臟、胸腺、外周血、脊髓細胞、T 細胞、B 細胞和成熟的樹突狀細胞( dendritic cell，DC) 中［6］。近年來研 究發(fā)現(xiàn)，Ｒunx3 與多種免疫細胞的發(fā)生發(fā)育也有關(guān)，尤其在淋巴細胞發(fā)生、發(fā)育及成熟中發(fā)揮重要作  用［7］。Th17 細胞的分化可受 Treg 細胞的調(diào)控，在強烈的 T 細胞受體信號和抗原提呈細胞存在下，Treg 細胞可分泌  IL-17，并轉(zhuǎn)化為  Th17 細胞［8］。Lequn Li  等［9］發(fā)現(xiàn) Ｒunx3 參與了 Treg 細胞轉(zhuǎn)化的過程。Apel  M 等［10］發(fā)現(xiàn)，Ｒunx3 基因突變與銀屑病關(guān)節(jié)炎的發(fā)生 相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Ｒunx3 在銀屑病患者中外周血中的表達具有特異性［11］。因此，本研究分析了 Ｒunx3 對銀屑病患者外周血 CD4 + T 細胞分化為 Th17，Treg細胞的影響，并分析了相應(yīng)的調(diào)控機制，從而為銀屑病  的防治提供新的研究方向。
1材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 研究對象 入選病例為 2013 年 11 月 － 2014 年 3 月在本院皮膚科門診確診的尋常性銀屑病患者58 例，其中男 31 例，女 27 例，年齡 14 ～ 65 歲，病程 6 個月 ～ 25 年。排除其他病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤等。對照組為本院體檢中心健康體檢者 50 例，男28 例，女 22 例，年齡 18 ～ 59 歲，采集血樣前 1 個月內(nèi)無感染情況，既往無銀屑病、血管炎等免疫相關(guān)性皮膚  病病史。兩組在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學(xué)意義( F =
1. 88，P ＞ 0. 05 ) 。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。
1. 1. 2 主要試劑 人淋巴細胞分離液和 ＲosetteSep 富集人  CD4 + T 細胞抗體( Stem Cell 公司) ; 胎牛血清 ( 浙江天杭生物科技有限公司) ; Trizol、Lipofectamine
2000 ( Invitrogen 公司) ; SYBＲ Master Mixture( 北京厚生博泰科技有限公司) ; Ｒunx3 siＲNA( 上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司) ; IL-17，IL-23，TGF-β，IL-10 ELISA 試
劑盒  ( 上海恒遠生物科技有限公司) ;   PE-IL-17，PE- CD3，PE -CD25，F(xiàn)ITC-CD4，F(xiàn)ITC-CD8，APC-Foxp3 (  美
國 eBioscience 公司) ; ＲOＲγt，F(xiàn)oxp3 抗體(  Cell Signal Technology) 。
1. 2 方 法
1. 2. 1 標本采集 無菌操作下采集所有研究對象靜脈血 10mL，肝素鈉抗凝，6h 內(nèi)用 Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法獲取細胞。具體操作如下: 向血樣中加入50 μL ＲosetteSep 富集人 CD4 + T 細胞抗體混合物，混勻，室溫孵育 20 min。用等體積含 2% FBS 的 PBS 稀釋血液，向 10 mL 淋巴細胞分離液的上面緩慢加入稀釋的血液樣品，血液與淋巴分離液的比例為 2: 1，室溫 1 200 r / min離心 20 min。收集位于淋巴細胞分離液與血漿界面之間的灰色細胞層。加入 5 倍體積含 2% FBS 的 PBS 混勻，800r / min 離心 10 min，棄上清，重復(fù) 1 次。流式細胞儀檢測 CD4 + T 細胞純度可達 90% 以上。
1.2. 2 總 ＲNA 的提取 取 1 × 106 CD4 + T 細胞，加入1 mL 預(yù)冷 Trizol，吹打細胞至*溶解，室溫靜置  5 min。嚴格按照 Invitrogen 公司的 Trizol 試劑說明書進行操作。后得到 ＲNA 沉淀溶于 10μL DEPC 水中。取 ＲNA 溶解液置于紫外分光光度儀中進行 ＲNA 濃度測定，讀取 260nm 與 280nm 的 A 值，利用 A260 / A280 的比值( Ｒ)  估計核酸的純度，Ｒ 值范圍控制在 1. 8 ～
2.0 之間。按照 TaKaＲa 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，首先除去基因組 DNA，依次加入 gDNAEraser Buffer 2μL，gDNAEraser1 μL，ＲNA 1 μg，用 ＲNase Free dH2 O調(diào)整制成 10 μL 反應(yīng)液，42℃ 靜置 2 min，之后進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下: PrimeScript Buffer 4 μL， PrimeScriptＲTEnzyme Mix 1 μL，ＲTPrimeMix 1 μL，步制成的 10 μL 反應(yīng)液，后用 ＲNaseFreedH2 O 將體積調(diào)為 20 μL。反應(yīng)條件: 42℃ ，反應(yīng) 60 min，70℃ 10 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，得到 cDNA 產(chǎn)物。
1. 2. 3    實時定量檢測 Ｒunx3，ＲOＲγt，F(xiàn)oxp3 mＲNA 水平    實時定量 PCＲ( qＲT- PCＲ) 檢測 mＲNA 的表達水平，以 β-actin 基因為內(nèi)參照，引物序列見表 1。PCＲ 反應(yīng)體系為 12. 5 μL SYBＲ Premix Ex Taqprimer，1 μL引物，2 μL 模板，其余用 ddH2 O 補齊至 25μL。PCＲ 循環(huán)參數(shù)為: 94℃ 預(yù)變性 5 min，1 個循環(huán)，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，35 個循環(huán)擴增，后 72℃ 5 min 結(jié)束反應(yīng)。
1. 2. 4    Ｒunx3 siＲNA 轉(zhuǎn)染
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