細(xì)胞核制備試劑盒詳細(xì)說明

一、 試劑盒說明

在破碎組織細(xì)胞時(shí)加入活化劑，幫助裂解細(xì)胞，反復(fù)振蕩或使用剪切力釋放細(xì)胞核，然后在溫和條件下低速 離心收集細(xì)胞核。制備在 30～60 分鐘內(nèi)完成，無需特殊設(shè)備，簡便易行，重復(fù)性好。適用于從組織塊、貼 壁或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制備完整的高純度細(xì)胞核。制備的細(xì)胞核仍然保持其在細(xì)胞內(nèi)所具有的形狀和大小，是進(jìn) 行細(xì)胞核組分亞分級(jí)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)的理想材料，是研究蛋白核轉(zhuǎn)位、DNA-蛋白相互作用，以及進(jìn)行 Western Blot 和免疫共沉淀的理想材料。

二、 試劑盒組份

三、 使用注意事項(xiàng)

1. 為保證獲得完整的細(xì)胞核，全程低溫操作，將樣品管放在冰水浴而不是碎冰塊中?？焖偻瓿刹僮?，微量 制備比大規(guī)模制備操作更方便和快速，因而更容易獲得完整的細(xì)胞核。

2.      破碎細(xì)胞是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞較難破壁，必要時(shí)將勻漿混合物 3

次或多次通過 22 號(hào)針頭剪切破碎細(xì)胞，或用小容積玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞

20~40 次。并不時(shí)用相差顯微鏡下檢查未裂解細(xì)胞應(yīng)少于 5%。

3.      以離心力 g 計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此計(jì)算離心速度。

4.     進(jìn)行 Western Blot 和 2D-膠電泳，可先用小體積的水重懸核沉淀，然后加入樣品緩沖液，如果直接用含 SDS 樣品緩沖液裂解核將釋放大量粘稠的 DNA 使樣品難以分散。反復(fù)加熱變性有助于 DNA 斷裂，可 通過細(xì)針頭反復(fù)抽吸打斷 DNA。

四、操作方法

A. 培養(yǎng)細(xì)胞裂解

1.     貼壁細(xì)胞需要消化或機(jī)械刮下細(xì)胞，懸浮細(xì)胞可直接離心，PBS 洗滌，800 × g, 5min 離心收集細(xì)胞， 計(jì)數(shù)，并估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積。每次提取需要 1~2 × 107 個(gè)細(xì)胞。通常每 1 × 107 個(gè)細(xì)胞的沉淀體積約

100 μL；

2.      加入 10 倍于細(xì)胞沉淀體積的 1 mL 冰預(yù)冷的 Lysis Buffer，振蕩重懸細(xì)胞；

3.      加入 1/20 體積約 50 μL Reagent A，振蕩混合；

4.      細(xì)胞懸液放冰水浴 10~20 分鐘，每 3~5 分鐘振蕩細(xì)胞 30 秒。在相差顯微鏡下檢查游離的核應(yīng)該達(dá)到

95%而未裂解細(xì)胞應(yīng)少于 5%。否則繼續(xù)冰浴和強(qiáng)烈振蕩，或置于玻璃勻漿器均漿數(shù)十次后再鏡檢。

B. 組織塊破碎和細(xì)胞裂解

1.      稱取 100~500 mg 新鮮組織如肝臟、腦，PBS 沖洗，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。估計(jì)

組織塊總體積。加入 1 ml 冰預(yù)冷的 Lysis Buffer；

2.      加入 1/20 體積約 50 μl Reagent A，混合；

3.      上下研磨組織 20 次。在相差顯微鏡下檢查游離的核應(yīng)該達(dá)到 95%而未裂解細(xì)胞應(yīng)少于 5%。否則繼續(xù) 勻漿；

4.      用濾紙或雙層紗布過濾組織勻漿裂解物。

C. 細(xì)胞核制備

1.      將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管。4 oC，1000 × g 離心 3 min 沉淀細(xì)胞核，棄上清；

2.      用 10 倍于胞核體積（約 0.5 mL ）Lysis buffer 重懸核，4 oC，1000 × g 離心 3 min，棄上清。

3.      加入 0.5 mL Medium Buffer A 重懸沉淀制成懸液；

4.      將另一預(yù)冷的新離心管內(nèi)加入 1 mL Medium Buffer B，將步驟 3 的懸液置于 Medium Buffer B 之上，4

oC，1000 × g 離心 10min ，棄上清，得較純的細(xì)胞核沉淀，此時(shí)在相差顯微鏡下細(xì)胞核應(yīng)該游離分散 在清亮背景下；

5.      用 Store Buffer 重懸細(xì)胞核，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-70 oC 保存。