Nanodrop One與Qubit 4的區(qū)別

凡是需要做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的lab，肯定逃不了要買一臺核酸定量的機(jī)器。目前流行的儀器是Nanodrop One，只需滴加一兩微升的樣品，按一下按鈕，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到濃度數(shù)據(jù)。近幾年，以Qubit 4為代表的基于特異熒光染料法的儀器也逐漸進(jìn)入科研人員的視野。那么，這兩類儀器有什么區(qū)別，在使用時(shí)需要注意什么，如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)室需求來選購？且聽老司機(jī)分解。

首先我們需要來理解兩臺儀器在核酸定量原理上的區(qū)別。正如方才所言，Nanodrop One利用了核酸的紫外吸收特性。

（圖1：Nanodrop One）

核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及堿基構(gòu)成。其中，由于堿基含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波長為260 nm。根據(jù)朗伯比爾定律，已知物質(zhì)的消光系數(shù)（幾十年前早已測量），液層的厚度（固定的樣品室），就能利用其吸光度來計(jì)算出物質(zhì)的濃度。與此同時(shí)，還能通過計(jì)算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計(jì)核酸的純度。（280 nm吸光通常來自蛋白質(zhì)，而230 nm則通常來自糖類和苯酚等。）

而Qubit 4這一類儀器采用的是熒光染料法。這些熒光染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結(jié)合，并在特定波長光源的激發(fā)下，發(fā)出熒光。其中，結(jié)合了核酸的熒光染料，相比那些游離的，信號可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以和背景區(qū)分開來。目前，做測序的實(shí)驗(yàn)室基本把Qubit 4當(dāng)標(biāo)配儀器了。

（圖2：Qubit 4.0）

雖然以Nanodrop One為代表的紫外吸收法在科研領(lǐng)域已經(jīng)沿用了數(shù)十年，但由于原理上的限制，這一類儀器有無法避免的缺陷。

1、紫外吸收法無法區(qū)分DNA和RNA

這一點(diǎn)其實(shí)在原理上就很好理解了。如下圖所示，具有紫外吸收的結(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當(dāng)一份樣品同時(shí)含有DNA和RNA的時(shí)候，無論你本意是想測哪一個(gè)，均會高估其真實(shí)濃度。

（圖3：核酸的結(jié)構(gòu)）

而Qubit 4的熒光染料法則避免了這個(gè)問題。只要采用DNA、RNA特異的染料，就能有選擇性地測定樣品中的核酸濃度。下圖是Qubit 4的*測試數(shù)據(jù)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是在DNA樣品中混合入不同比例的RNA，并用Qubit 法和紫外吸收法分別進(jìn)行測定。當(dāng)DNA的樣品足夠純時(shí)（DNA：RNA = 10：0），兩種方法測得的數(shù)值并沒有顯著區(qū)別。但當(dāng)混入的RNA越來越多，紫外吸收的數(shù)值也跟著升高（藍(lán)色和綠色柱子），而使用雙鏈DNA染料的Qubit數(shù)值則沒有改變（紅色柱子）。使用RNA染料用Qubit 4進(jìn)行測定，則會發(fā)現(xiàn)，隨著RNA混入的增加，讀數(shù)也跟著升高。

（圖4：Qubit和紫外吸收法對DNA-RNA混合樣品的測定）

目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質(zhì)均有特異的熒光染料。也就是說，無需專門純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。

2、紫外吸收法的定量限較高

記得有一次做實(shí)驗(yàn)，放了0.5 µg質(zhì)粒做酶切，跑膠回收于30 µl的溶液中，然后做Nanodrop測定濃度，后數(shù)值約為25 ng/µl……

于是本司機(jī)得到的結(jié)論是：我們實(shí)驗(yàn)室的那臺Nanodrop一定是內(nèi)置了賢者之石（霧——） 還是去隔壁借用一下Qubit吧。

其實(shí)是這樣的，對于任何儀器分析，我們都應(yīng)該去理解其檢出限和定量限。Nanodrop標(biāo)稱的檢出限是2 ng/µl（雙鏈DNA），然而定量限則遠(yuǎn)高于此。其他的Nanodrop one用戶也有類似的體驗(yàn)，曾經(jīng)在ResearchGate上看到說，低于50 ng/µl的話就容易測不準(zhǔn)，變異度會增大。以下同樣是來自Qubit的*數(shù)據(jù)。當(dāng)DNA的濃度低于某個(gè)程度時(shí)，紫外吸收法的偏差和變異度就突破天際了。

（圖5：Qubit與紫外吸收法測定低濃度DNA時(shí)的偏差及變異度比較）

這兩張圖中，紫外吸收法得到的偏差和變異度在我看來已經(jīng)算小的了（不能搞太大啊，不然沒人買怎么辦？數(shù)據(jù)來自Thermo Fisher公司，但他們家兩類儀器都有，手心手背都是肉），要低于4 ng/µl雙鏈DNA才會亂飆車。然而在實(shí)際使用中，低于10甚至20 ng/µl時(shí)就比較容易出亂子。而PCR產(chǎn)物膠回收等應(yīng)用，終的實(shí)際濃度往往就落在這個(gè)容易測不準(zhǔn)的范圍內(nèi)。雖然這對老司機(jī)們來說還不至于把下游實(shí)驗(yàn)搞砸，但測不準(zhǔn)還是很郁悶的。

3、紫外吸收法對溶液的pH和鹽濃度敏感

在研究物質(zhì)吸光度時(shí)，我們總要明確地定義緩沖液的離子強(qiáng)度以及pH，這就說明，吸光度本身是受到這兩個(gè)因素影響的。

通常而言，偏酸的溶液，容易給出偏低的A260/A280數(shù)值。相反，偏堿的溶液則容易高估。相應(yīng)地，也有報(bào)道稱，當(dāng)用水作為溶劑時(shí)，紫外吸收測定的數(shù)值變異度增大，而當(dāng)使用Tris或Tris-EDTA溶液進(jìn)行測定時(shí)，重復(fù)性就提高了。這其中的原因，很可能是空氣中溶解入水中的CO2濃度差異造成的。離子強(qiáng)度對于紫外吸收的影響比較復(fù)雜，這里不展開。

相比之下，熒光染料法對樣品的污染和pH等的容忍度較大。

4、紫外吸收法對降解比較嚴(yán)重的核酸無能為力

這一點(diǎn)，同樣也是由紫外吸收原理的局限性所決定的。紫外吸收測定的對象是堿基，因此無論核酸是完整成鏈的，還是降解成單個(gè)游離核苷酸，該方法均無法加以區(qū)分。盡管我們可以通過A260/A280數(shù)值是否過大來估計(jì)核酸樣品的降解狀況，但卻無法選擇性地只測定那些結(jié)構(gòu)完整的核酸的濃度。

而熒光染料通常結(jié)合的是核酸的鏈結(jié)構(gòu)，并不會與游離的單核苷酸相互作用。不過話說回來，對于那些尚未降解成單個(gè)核苷酸而呈短鏈狀態(tài)的核酸，熒光染料法是無法將其與完整核酸區(qū)分開來的。

[咚咚咚！敲黑板！]

但是，紫外吸收法也不是一味的爛，熒光染料法也不是說吊打（大面積吊打還是做得到）。

如果在實(shí)驗(yàn)中獲得的核酸樣品總是很純凈且均一（如原材料是容易對付的培養(yǎng)細(xì)胞，還用品質(zhì)好的試劑盒進(jìn)行抽提；而非奇奇怪怪的樣品，還要是自己配的試劑），同時(shí)產(chǎn)量又很高，那紫外吸收法*可以勝任，外加測定速度熒光染料法。此外，熒光染料法對溫度比較敏感，比如上一回是在25℃室溫制作并儲存的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而這一回要測定樣品時(shí)實(shí)驗(yàn)室空調(diào)壞掉，一下子有了3℃以上的溫差，那么標(biāo)曲就得重新制作。同時(shí)，熒光染料要現(xiàn)用現(xiàn)配，樣品至少要染2 min，花費(fèi)的時(shí)間比紫外吸收法要長。

以下用一張表總結(jié)兩者的優(yōu)劣。請根據(jù)自己的實(shí)際情況斟酌。