普通 PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 對(duì)比分析

 提起 PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)可謂如雷貫耳，**，其影響之深，應(yīng)用之廣可見一斑。
    1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），實(shí)現(xiàn)了在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應(yīng)用使得 PCR 能率的進(jìn)行，隨后 PE-Cetus 公司推出了臺(tái) PCR 自動(dòng)化熱循環(huán)儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。
    根據(jù) PCR 的發(fā)展進(jìn)程，本文將對(duì)普通 PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進(jìn)行分析，期望對(duì) PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。

普通 PCR

基本原理
    PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種體外 DNA 擴(kuò)增技術(shù)，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的 DNA 片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。

PCR 反應(yīng)體系舉例

儀器與耗材

    基于聚合酶制造的 PCR 儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在此不再贅述。

結(jié)果檢測(cè)

    PCR 反應(yīng)擴(kuò)增出很高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。

應(yīng)用

    PCR 是一種用于放大擴(kuò)增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，大特點(diǎn)是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是「微量證據(jù)」的威力之所在。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR） 

基本原理

    qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號(hào)不斷積累， 從而利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程。
    根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出， 模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光強(qiáng)度與 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系， 只要對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品的起始拷貝數(shù)。
    Ct 值指 PCR 擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。相同模板進(jìn)行 96 次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻重現(xiàn)性。

    模板 DNA 量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。

目前常用熒光標(biāo)記方法

儀器與耗材

    在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴(kuò)增原理和普通 PCR 儀擴(kuò)增原理相同，只是 PCR 擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出，把這 PCR 儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時(shí)候用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機(jī)構(gòu)。