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數(shù)字PCR應(yīng)用及前景
一. PCR的發(fā)展歷史
PCR技術(shù)自問世以來,在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領(lǐng)域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用。代 PCR在進(jìn)行擴(kuò)增后通過凝膠電泳進(jìn)行定性分析。
隨著生物分子熒光技術(shù)的發(fā)展,1992年實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應(yīng)運(yùn)而生。qPCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)熒光強(qiáng)度來測定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以Ct值也就成為定量的依據(jù)?;跓晒馓结樆蛉玖系牡诙?PCR 技術(shù)隨后逐漸發(fā)展為檢測核酸目標(biāo)片段的主流分子診斷學(xué)技術(shù)。
在實(shí)時定量 PCR(qPCR) 過程中,熒光信號隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的積累而增強(qiáng)。qPCR 能夠?qū)崟r獲得模板擴(kuò)增的熒光值,然后根據(jù)DNA 模板在指數(shù)增長時期的 Ct 值與標(biāo)準(zhǔn) DNA 的Ct值比較來計(jì)算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應(yīng)系統(tǒng),非特異性的擴(kuò)增增加了假陽性結(jié)果和背景信號,因此,終無法獲得定量的結(jié)果。
隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術(shù)的不斷發(fā)展,新一代PCR技術(shù),數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現(xiàn)。digital PCR是一種新的定量PCR,主要是對PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋,隨后在不同的反應(yīng)腔室里進(jìn)行PCR擴(kuò)增,后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。
圖1. PCR技術(shù)的發(fā)展歷程
二. 數(shù)字微流控(dPCR)的原理
20 世紀(jì)末,Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR,dPCR) 的概念,通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應(yīng)單元,每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ,在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
dPCR是一種核酸分子定量技術(shù)。
dPCR一般包括兩部分內(nèi)容,即PCR擴(kuò)增和熒光定量分析。
在PCR 擴(kuò)增階段,與傳統(tǒng)技術(shù)不同,dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平,并平均分配到幾萬個反應(yīng)腔室里反應(yīng)。這樣子相當(dāng)于變相的對靶基因進(jìn)行富集。與此同時,由于對原樣品的大幅度的稀釋,使得PCR抑制劑濃度顯著降低,這樣dPCR對初始PCR反應(yīng)物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。
不同于 qPCR對每個循環(huán)進(jìn)行實(shí)時熒光測定的方法,dPCR 技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集,后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。
圖2. dPCR基本原理
三. dPCR與qPCR的對比
相對于熒光定量PCR(qPCR)而言,dPCR具備以下優(yōu)勢:
1、 靈敏度可達(dá)單個核酸分子:檢測限低至0.001%,原因在于dPCR可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)DNA/RNA的富集;
圖3. dPCR可以實(shí)現(xiàn)痕量核酸的高靈敏檢測
2、 無需標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)曲線),即可對靶分子起始量進(jìn)行定量;
3、 特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測:終點(diǎn)PCR檢測,不依賴Ct值,不依賴擴(kuò)增效率,能克服PCR抑制劑的影響,適合動血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等復(fù)雜樣品中DNA的定量;
4、 能夠有效區(qū)分濃度差異(變化)微小的樣品:更好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性,可以用于測定靶基因的相對表達(dá),基因拷貝數(shù)變異分析等。