ImageXpress Micro高內(nèi)涵3D細胞球成像檢測手冊

一、概述

1 當(dāng)前細胞培養(yǎng)和觀察的常用方法

十九世紀(jì)起，當(dāng)顯微鏡出現(xiàn)后，人們就開始嘗試對細胞結(jié)構(gòu)進行觀察，并在二十世紀(jì)發(fā)展出細胞的培養(yǎng)技術(shù)。單層細胞的培養(yǎng)相對方便，而且商業(yè)化的顯微鏡非常適合于平面的、薄樣品的觀察，所以，在二十世紀(jì)的中后期，人們普遍采用 2D 的細胞培養(yǎng)方法，進行生物學(xué)的研究，以及進行藥物的篩選、開發(fā)和疾病治療的研究。

2 2D 和 3D 細胞培養(yǎng)及對細胞的影響

通常，2D 細胞培養(yǎng)不但被用來在體外研究不同類型的細胞，還被用來進行藥物的篩選和評價等各個方面。這種單層的培養(yǎng)體系使細胞生長于聚酯或玻璃的表面，同時存在的培養(yǎng)液能夠給細胞生長提供養(yǎng)分。無數(shù)的生物學(xué)家通過這種方式極大地推動了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)進展。

然而，其簡單的操作方法也造成了這種模式無法準(zhǔn)確的描述和模擬細胞在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境和各種復(fù)雜生物學(xué)過程，如細胞信號傳遞，生化過程或幾何學(xué)改變。另外通過 2D 細胞培養(yǎng)方法獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用于體內(nèi)也會造成一些誤導(dǎo)和不可預(yù)測性。這些原因促使很多科學(xué)家將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了 3D 細胞培養(yǎng)技術(shù)，一種在體外能夠更加準(zhǔn)確描述細胞真實微環(huán)境的方法。細胞在體外三維環(huán)境下生長產(chǎn)生特殊的生物物理和生物力學(xué)信號，這些都會影響到細胞的功能，如細胞遷移、細胞粘附、增殖和基因表達等 ( 如下圖 )。

我們知道，有多種不同的 3D 細胞培養(yǎng)方法，不同的方法有著各自的優(yōu)點和缺點。與 2D 培養(yǎng)不同，3D 細胞培養(yǎng)具有微小結(jié)構(gòu)的形成和復(fù)雜的環(huán)境特征，能夠促進細胞的分化和組織形成。實際上，相比較于生長于 2D 環(huán)境，在 3D 環(huán)境中細胞能夠承受更多的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)變化。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞基底的成分和結(jié)構(gòu)不但能夠影響基因表達，還能增強細胞間聯(lián)系。如有些促進細胞增值的基因在 3D 培養(yǎng)環(huán)境下受到抑制，從而不會像 2D 培養(yǎng)下那樣無限生長。3D 細胞培養(yǎng)還會促進共培養(yǎng)環(huán)境下的兩種不同細胞群體的生長，從而能夠準(zhǔn)確重現(xiàn)組織功能。另外，3D 培養(yǎng)技術(shù)能夠使細胞微環(huán)境參數(shù) ( 溫度、化合物濃度、氧氣、pH 等 ) 易于控制和監(jiān)測。

但是 3D 細胞培養(yǎng)技術(shù)也有明顯的缺陷，這些缺陷還需要技術(shù)進步來彌補。首先，一些基質(zhì)膠會從動物或其他來源吸收一些有害或不需要的物質(zhì)，如病毒，可溶性因子等，會干擾細胞培養(yǎng)。有些基質(zhì)具有很好的細胞粘附性，使細胞去除過程更加困難。 另外，3D 細胞培養(yǎng)技術(shù)是一種高性價比的技術(shù)，能夠在藥物評價階段省掉動物藥物測試過程，整個流程可實現(xiàn)自動化，可重復(fù)性好。

3 3D 細胞技術(shù)的延伸和前景

隨著 3D 細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和成熟，大量的新的相關(guān)技術(shù)出現(xiàn)，如微流控技術(shù)、微器官技術(shù)等。這些技術(shù)使得培養(yǎng)環(huán)境的控制和監(jiān)測更加容易，同時能夠使藥物推進臨床的速度大大加快，評價結(jié)果的可靠性也會大大增加。

二、3D 細胞球培養(yǎng)方法

根據(jù) 3D 細胞培養(yǎng)中細胞生長情況，分為兩種方法，基于 Scaffold 基質(zhì)膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細胞培養(yǎng)法和無基質(zhì)(SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細胞培養(yǎng)。

1 基質(zhì)的類型

基質(zhì)是3D細胞培養(yǎng)的重要成分，根據(jù)不同的培養(yǎng)條件和目的，選擇不同的基質(zhì)。

2 基于 Scaffold 基質(zhì)膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細胞培養(yǎng)法

基質(zhì)為細胞培養(yǎng)中的細胞提供支撐。細胞能夠增殖并遷移進入基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，終粘附到基質(zhì)上。當(dāng)細胞生長時，成熟細胞相互影響，并終形成接近于細胞來源組織的微型結(jié)構(gòu)。在大部分情況下，這些細胞會表現(xiàn)為尺寸各異的球形，稱為細胞球：這些細胞結(jié)構(gòu)通常用于藥物篩選、評價或者其他 3D 細胞的應(yīng)用。通常，有基質(zhì)支撐的 3D 細胞培養(yǎng)方法獲得的細胞球，由于基質(zhì)提供了較大的接觸面積，其大小會比沒有基質(zhì)支撐的方法獲得的細胞球更大。

2.1 基質(zhì)的種類和成分

根據(jù)培養(yǎng)的細胞類型的不同，基質(zhì)蛋白纖維的特性和形狀應(yīng)與之相配合?；|(zhì)蛋白纖維的布局應(yīng)與模擬的器官結(jié)構(gòu)相符，具有類似的結(jié)構(gòu)、尺度和功能。然而，基質(zhì)纖維越大、結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，就越難以提取。另外，為了防止任何可能出現(xiàn)的障礙 ( 免疫反應(yīng)、纖維化、影響生長 )，無論采用何種類型的基質(zhì)，所采用的基質(zhì)都必須為細胞生長提供支撐，并具有生物相容性?；|(zhì)可以是水凝膠，薄膜 ( 或者管狀 )，和 3D 基質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2.2 水凝膠基質(zhì)

凝膠具有很好的力學(xué)特征，是常用的基質(zhì)。它具有類似于組織的剛性，在某種程度上能夠很好地模擬細胞外基質(zhì)的作用。事實上，就像其他的基質(zhì)，凝膠這種空洞結(jié)構(gòu)就像一個能夠保持營養(yǎng)物質(zhì)和可溶性因子 ( 如細胞因子、生長因子 ) 的細胞外基質(zhì)，這些可溶性因子由細胞產(chǎn)生，在凝膠種擴散，使細胞通過非直接接觸的方式進行通訊聯(lián)系。通過這種方法，非常適合于進行微型細胞實體組織的模擬，并在此基礎(chǔ)上進行藥物的毒性檢測和評價等。

包含大量水和天然生物分子 ( 藻酸鹽、明膠、透明質(zhì)酸、瓊脂糖、層粘連蛋白、纖維蛋白 ) 都可作為基質(zhì)。但是其凝膠化基質(zhì)比較復(fù)雜，會使制備和操作非常困難。

合成的和天然的生物聚合物也可作為 3D 培養(yǎng)的凝膠。根據(jù)實驗條件和終目的，可找到多種不同的聚合物，包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作，更適合于構(gòu)建基質(zhì)。

其他類型基質(zhì)：除了水凝膠外，還有很多基質(zhì)材料可用。非凝膠聚合材料基質(zhì)常用于組織工程，不同的材料都需要符合所要模擬器官的機械和物理學(xué)特征。

3 無基質(zhì) (SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細胞培養(yǎng)

要形成細胞球，細胞團塊即可作為一種很好的生理模塊而無需依賴于固體物質(zhì)的支持。這樣獲得的細胞球通常比較小，也相對松散。主要的 scaffold-free 3D 細胞培養(yǎng)法就是 forced-floating ( 強制浮動法 ), hanging drop ( 懸滴法 ) 和 agitation based( 攪動法 )。

forced-floating ( 強制浮動法 ) 是用*低粘附的聚合物包被的多孔板來進行。通過向孔內(nèi)加入細胞懸液后進行離心獲得。

懸滴法是通過將含有細胞的液滴處理，使細胞聚集為緊湊的均一的細胞球。

agitation based ( 攪動法 ) 使用生物反應(yīng)器獲得三維的細胞球結(jié)構(gòu)。