一體化細(xì)胞免疫熒光技術(shù)方案

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
一．傳統(tǒng)的免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟
（一）、實(shí)驗(yàn)材料 
1. 細(xì)胞樣品 
2. 試劑、試劑盒： 多聚甲Quan；70% 甲醇；丙Tong；PBS；Triton ；BSA；DAPI 染液；DABCO；Tris；甘油   
3. 儀器、耗材：玻片     

（二）、實(shí)驗(yàn)步驟     
細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟 
天：
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；

2. 用 4% 的多聚甲Quan固定爬片 15 min， PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS 配制 ) 室溫通透 20 min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）；

4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水紙吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉 30 min；

5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃ 孵育過(guò)夜；

第二天：

6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中 20-37℃ 孵育 1 h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3 min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。

7. 復(fù)染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4 次洗去多余的 DAPI；

8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀(guān)察采集圖像

二 傳統(tǒng)免疫熒光實(shí)驗(yàn)主要問(wèn)題

1. 爬片效果欠佳
2. 細(xì)胞和試劑用量大，成本高
3. 染液分布不均
4. 操作繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力

三. 一體化免疫熒光技術(shù)簡(jiǎn)介 
一體化的培養(yǎng)室-固定-染色-成像 免疫熒光的解決方案

技術(shù)特點(diǎn)：
1.快速簡(jiǎn)便的樣品制備,一體化培養(yǎng)室簡(jiǎn)化了免疫熒光染色方案
2.均勻細(xì)胞分布,通道載玻片幾何結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生均勻的細(xì)胞分布
3.經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的實(shí)驗(yàn)方案，需要少量的細(xì)胞和試劑
4.高分辨率成像，適用于寬場(chǎng)熒光，共焦成像，F(xiàn)RAP-FRET-FLIM和高質(zhì)量的相差成像（Phase Contrast）
 
主要工作模式：
1. 通道模式：ibidi通道載玻片是使用少量試劑的理想選擇。μ-Slides VI0.4是一般免疫熒光檢測(cè)的理想選擇，而μ-Slide I0.4Luer可在低密度培養(yǎng)和流動(dòng)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行免疫熒光染色。

2.開(kāi)放腔室模式
Ibidi μ-Slide 8 孔和μ-Dish35mm 能夠在全內(nèi)腔中實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光方案，無(wú)蓋玻片。染色后，使用高分辨率顯微鏡通過(guò)聚合物蓋玻片底部觀(guān)察樣品。

3. 可拆卸腔室載玻片模式
帶有腔室的可拆卸硅墊片為個(gè)體細(xì)胞培養(yǎng)和孵育提供了理想的模式。ibidi micro-Insert 4 Well可以使用極低的試劑量。可拆卸3Well|8Well|12 Well Chambers是長(zhǎng)期樣品儲(chǔ)存的理想選擇。

1. 一體化免疫熒光技術(shù)應(yīng)用舉例

*過(guò)800篇參考文獻(xiàn)證明了使用ibidi產(chǎn)品進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

1. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured under flow conditions in μ-Slide I ^0.4 Luer

藍(lán)色: nucleus (DAPI)
綠色: VE-cadherins (Alexa 488 conjugated antibody)
紅色: actin cytoskeleton (Cy5 conjugated antibody)

2. Cell line Madin-Darby canine kidney (MDCK) cultured in μ-Slide VI ^0.4

藍(lán)色: nucleus (DAPI)
綠色: actin cytoskeleton (Alexa 488 conjugated antibody)
紅色: mitochondria (MitoTracker)

3. Differentiated mouse fibroblasts cultured on elastic surface (ESS 28 kPa)

綠色: zyxin (Alexa 488 conjugated antibody)
紅色: alpha-smooth muscle actin (Cy5 conjugated antibody)

產(chǎn)品技術(shù)參數(shù)表

五. 總結(jié)和評(píng)價(jià)
（1）這種腔式載玻片／培養(yǎng)皿，不需要包被，不需要爬片，培養(yǎng)細(xì)胞－沖洗玻片－固定細(xì)胞－染色－成像，所有步驟都在這個(gè)  載玻片就可以完成，直接鏡檢成像效果良好；
（2）如果希望做完實(shí)驗(yàn)還可以封片保存的，有這種可移除的腔式載玻片，3孔8孔12孔，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇，種好細(xì)胞染色之后，就可以撕掉框架，直接觀(guān)察或者封片保存；
 （3）如果實(shí)驗(yàn)希望做小容量的，這種通道載玻片，跟普通免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)比，用槍加液和吸液就可以完成所有免疫熒光步驟，操作更簡(jiǎn)單；節(jié)省細(xì)胞節(jié)省試劑，一個(gè)通道只需要25微升液體；保證細(xì)胞分布均勻，得到更好的觀(guān)察結(jié)果；
（4）如果實(shí)驗(yàn)需要做大容量的，或者做長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞觀(guān)察的，IBIDI培養(yǎng)皿，底部比普通載玻片的成像效果要好，可以直接完成所有細(xì)胞操作和觀(guān)察，這個(gè)有配套的蓋子可以減少污染，杜絕蒸發(fā)，蓋子可鎖可不鎖，鎖上的話(huà)，蒸發(fā)率基本為零，適合長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察細(xì)胞；
（5）如果實(shí)驗(yàn)需要定期觀(guān)察同一個(gè)細(xì)胞／重新找回某一個(gè)之前觀(guān)察過(guò)的細(xì)胞，或計(jì)數(shù)細(xì)胞，有帶計(jì)數(shù)格的培養(yǎng)皿和腔式載玻片（8孔的），只要記住細(xì)胞的坐標(biāo)，每次都可以輕松找回同一個(gè)細(xì)胞，不像平常用記號(hào)筆標(biāo)記的那么不準(zhǔn)確，記號(hào)筆的痕跡還會(huì)影響觀(guān)察；
（6）如果實(shí)驗(yàn)要做高通量的免疫熒光，比如藥篩，有24孔板，96孔板，384孔，價(jià)格和市面的多孔板差不多，多孔板不需要包被，也不會(huì)有自發(fā)熒光，孔壁是黑色的，所以孔和孔之間的免疫熒光不會(huì)互相影響；
（7）這些耗材專(zhuān)門(mén)為共聚焦*分辨顯微成像設(shè)計(jì)，效果很好；
（8）這些產(chǎn)品都是通過(guò)ibidi的物理方法ibiditreat處理，底部都是*薄親水的，大多數(shù)種類(lèi)細(xì)胞都可以直接貼壁生長(zhǎng)的，不需要另外包被了；如果有特殊實(shí)驗(yàn)需求，可以自己再包被的（選擇uncoated版本）；