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病毒的*低溫保存法
大多數(shù)微生物可用*低溫保存,*低溫保存法是適用范圍廣的微生物保存法。需要復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)的微生物種,如用其他的貯存方法不能保持其活力(如植物的病原性真菌),通常可用*低溫的方法保存(ATCC 1983;Halliday,Baker 1985)。此法是將凍存在小管或安瓿里的細(xì)胞以較慢的冷凍速率(1℃/分鐘)冷凍,直至—150℃,再將這些小管貯存在—150~-196℃的液氮中。
*低溫的冷凍保護(hù)劑不同于凍干法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油(10%)、二甲亞砜(5%)和培養(yǎng)液制成的混合劑保存多數(shù)的細(xì)胞株。這些化學(xué)試劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)可避免內(nèi)膜的冷凍損傷。 貯存在低溫容器內(nèi)的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)必須小心操作。當(dāng)小管被加熱時(shí),所形成的冰晶會(huì)將細(xì)胞殺死,正確操作就可避免這種事故。只要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失,做法是:將封口的小管迅速放入37℃的水中,直至所有的冰融化,然后打開(kāi)管口,將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。
*低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環(huán)境中,因此需要液氮罐。在長(zhǎng)期貯存的過(guò)程中必須經(jīng)常注意補(bǔ)充液氮。這種貯存方式比凍干法需要更多的經(jīng)費(fèi),包括為了維持貯存溫度所必要的勞動(dòng)力和液氮等。
2.2 材料
病毒*低溫保存所需材料有:熱收縮塑料管(Nunc Cryoflex),液氮罐,防護(hù)手套和面罩,久性記號(hào)筆,氣體噴燈,裝液氮的保溫瓶。
2.3 方法
(1)剪一段兩端各*出冷凍管長(zhǎng)度2cm 的熱收縮塑料管。
(2)將含有澄清病毒懸液(組織培養(yǎng)的上清培養(yǎng)基,或組織培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物均可)冰浴幾分鐘,用滅菌移液管將0.2ml 冰浴過(guò)的上清懸液分裝到冷凍管內(nèi),并將蓋子擰緊。
(3)將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部,插入正確的標(biāo)簽。
(4)用噴燈小心加熱熱收縮塑料管,并使之包住冷凍管。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管。
(5)再小心加熱熱收縮塑料管的兩端,用大號(hào)鑷子夾緊管的端口至*密封。
(6)將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍(操作時(shí)要求戴面罩和手套)。
(7)將冷凍過(guò)的冷凍管放入液氮罐中的格子內(nèi),同時(shí)記錄樣品的詳細(xì)的存放位置、實(shí)驗(yàn)編號(hào)和存放日期等。
(8)需要用時(shí),迅速?gòu)囊旱迌?nèi)取出所需樣品,并投入37℃水浴箱中解凍后,用解剖刀片在冷凍管的硅化墊圈處切開(kāi)熱收縮塑料管。擰開(kāi)冷凍管的蓋子時(shí)不需要除去熱收縮塑料管。