熒光定量pcr儀的使用方法

什么是數(shù)字PCR？

數(shù)字PCR是一種新的定量PCR，通過對PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。

什么是多重PCR？

多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)；由Chambehian'于1988年*提出,其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適,引物對的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實(shí)際能夠擴(kuò)增的引物對數(shù)量是有限的。

什么是多重?cái)?shù)字PCR？

多重?cái)?shù)字PCR是在同一數(shù)字PCR反應(yīng)體系里加上兩對或兩對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個核酸片段的數(shù)字PCR反應(yīng)。將多重PCR技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合而形成的多重?cái)?shù)字PCR，根據(jù)DNA探針不同熒光度、DNA擴(kuò)增不同循環(huán)數(shù)及多種標(biāo)記熒光同時(shí)使用，便可大幅提高數(shù)字PCR多重性，多重性可達(dá)20-50以上，即同時(shí)在一個PCR反應(yīng)單元內(nèi)進(jìn)行20-50個以上的數(shù)字PCR反應(yīng)。

多重?cái)?shù)字PCR在醫(yī)學(xué)檢測中的優(yōu)勢

在數(shù)字PCR中實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。在一個PCR反應(yīng)中完成基因多個突變位點(diǎn)的檢測，即一個PCR反應(yīng)即可完成一個Panel的檢測，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著不可替代的優(yōu)勢。

其優(yōu)勢可以簡單概括為以下三點(diǎn)：

1高效性。
在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種核酸片段，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。

2系統(tǒng)性。
多重?cái)?shù)字PCR很適宜于成組核酸片段的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞厭氧菌。

3經(jīng)濟(jì)簡便性。
多種核酸片段在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，節(jié)省時(shí)間、試劑耗材和經(jīng)費(fèi)，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的檢測信息。

多重?cái)?shù)字PCR的檢測類型

數(shù)字PCR的多重檢測主要通過以下兩種方式實(shí)現(xiàn)：

1、多個熒光通道。使用多種熒光染料來標(biāo)記不同的要檢測的靶基因。

2、單波長多強(qiáng)度。使用一種熒光染料，但是擴(kuò)增結(jié)束時(shí)不同的靶基因?qū)?yīng)的染料的熒光強(qiáng)度不一樣。

多重?cái)?shù)字PCR在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用舉例：

1.多重?cái)?shù)字pcr技術(shù)檢測肺癌EGFR基因突變

來源：Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166

EGFR基因突變位點(diǎn)的檢測是指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者臨床用藥的依據(jù)。其中常見的是21號外顯子L858R突變，19號外顯子缺失以及20號外顯子T790M突變。但是臨床樣本往往是有限的，尤其是液態(tài)活檢樣本，因此多重檢測可以節(jié)省大量檢測樣本及檢測成本。

2，多重?cái)?shù)字pcr技術(shù)在染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用

來源：Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247

High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes

數(shù)字PCR技術(shù)具有單分子靈敏度和定量的能力，能夠區(qū)分微小差異，很適合用來進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分，常規(guī)實(shí)驗(yàn)一對引物探針要想準(zhǔn)確分辨胎兒染色體倍數(shù)需要提高足夠多的模板（約41-252ng，胎兒DNA比例10%-4%），這么大量的DNA臨床一般無法提供(1ml血常規(guī)只能獲得1-7ng cfDNA)，這時(shí)通過多重?cái)?shù)字PCR設(shè)計(jì)40對引物和2個通用探針擴(kuò)增21號和18號染色體上的各20個片段，就能很好的解決這個問題。結(jié)果顯示以10ng cfDNA作為起始模板，使用多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確性分辨21-三體綜合征。

3.探針成本太高，沒關(guān)系我們用染料法也可以做多重?cái)?shù)字PCR

來源：Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27

通過改變擴(kuò)增產(chǎn)物的長度，或者調(diào)整引物的量，或者改變反應(yīng)的Tm值等條件，可以輕松嘗試多重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)。

4.染料法也可以檢測點(diǎn)突變

染料法也可以檢測SNP點(diǎn)突變，通過在上游引物末端添加一段序列，改變突變型或野生型擴(kuò)增產(chǎn)物長度即可輕松實(shí)現(xiàn)多重檢測。

 1.儀器的檢測通量（Throughput）
    首先要考慮實(shí)驗(yàn)室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學(xué)舊金山分校癌癥中心的基因組分析設(shè)備負(fù)責(zé)人David Ginzinger檢測過市面上絕大多數(shù)的定量PCR儀。他表示，如果不是大規(guī)模批量使用，比如說主要是用來檢測驗(yàn)已知基因，那確實(shí)不需要昂貴的產(chǎn)品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室，就需要能容納384孔板、運(yùn)行時(shí)間更快的儀器。不過僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的，你會發(fā)現(xiàn)樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實(shí)驗(yàn)室往往需要進(jìn)一步的自動化儀器，只要“按一下鈕”，儀器就會自動處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
 
   2.多重?cái)U(kuò)增的能力 
    多重?cái)U(kuò)增越來越熱。實(shí)時(shí)定量PCR儀也不能幸免。定量PCR儀擁有多個檢測通道，因而儀器就可以檢測同一個樣品槽里多個模板的擴(kuò)增過程。新的LightCycler2.0 有6個檢測通道，比原來多了3個。SmartCyclerⅡ有4個檢測通道。以文庫產(chǎn)品而名滿天下的Stratagene也有一種價(jià)格不到Roche的一半、口碑不錯的定量PCR儀Mx3000P，也就是4個檢測通道。不過多重?cái)U(kuò)增并非人人適用，因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了。
 
  3．軟件 
     當(dāng)你準(zhǔn)備選擇一臺定量PCR儀，你必須要檢測附帶的軟件。使用方便嗎，是否可以進(jìn)行你所需要的分析，輸出格式有幾種。不過，你需要留意，太容易使用的軟件是不是功能比較簡單而無法進(jìn)行復(fù)雜計(jì)算，以前的軟件還需要你做進(jìn)一步分析，新的軟件已經(jīng)可以處理一切了。除了基本功能，部分軟件還可以有更多的功能，比如引物和探針設(shè)計(jì)、多重分析設(shè)計(jì)、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化等等。Roche應(yīng)用科學(xué)部的應(yīng)用和技術(shù)服務(wù)部負(fù)責(zé)人Willian Demyan 就強(qiáng)調(diào)：定量PCR是一個幾何擴(kuò)增的過程，開始時(shí)一個拷貝之差，結(jié)果就有幾何數(shù)量級之別。
 
    4.靈活性 
    大規(guī)模繁忙的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備*固然令人羨慕，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室同樣可以有精彩的選擇?，F(xiàn)在的供應(yīng)商都擁有眾多的技術(shù)專家，不單了解你的目前需要，還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化，比如提供多種可升級配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級為實(shí)時(shí)定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽，可以將96孔槽變?yōu)殡p384孔槽而滿足部分高通量的需求。對于剛開始小量做qPCR的實(shí)驗(yàn)室來說，SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個好選擇，一個基本模塊有16個獨(dú)立控溫樣品槽，可以同時(shí)或者前后分別進(jìn)行16個*獨(dú)立的不同實(shí)驗(yàn)， “隨機(jī)存取”；當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要較大規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以非常經(jīng)濟(jì)地升級，從1個增加到6個基本模塊，也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板，但是當(dāng)一個學(xué)生開始小量實(shí)驗(yàn)，其他人還可以隨時(shí)插進(jìn)去開始自己的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，而且互不干擾，就是增加了靈活性。對于剛開始只做少量實(shí)驗(yàn)而且預(yù)算較緊張的實(shí)驗(yàn)室來說是非常靈活的選擇。
 
    5.不確定性 
   盡管軟件可以做部分修正，購買一臺系統(tǒng)誤差較少的儀器，無需那么多計(jì)算修正總比靠計(jì)算修正好。Cinzinger 就認(rèn)為，要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了*的樣品孔之間的溫度差異，還有樣品孔和檢測探頭之間光程距離、負(fù)責(zé)收發(fā)和傳遞信號的光纖長度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對信號傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數(shù)的市售的定量PCR儀做過同樣的測試，他將同樣的樣品和反應(yīng)試劑在儀器的每一孔進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增。很不幸，很多時(shí)候，不同樣品孔之間會有不同的結(jié)果。