熒光定量PCR耗材的使用和選擇注意事項

高通量的96孔PCR板和8聯(lián)管是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)中，主要作為參與擴增反應(yīng)的引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、模板核酸、Mg、緩沖液等的承載物。醫(yī)療級聚丙烯（PP）材質(zhì)因其*的純凈度和穩(wěn)定性，能更好適應(yīng)PCR反應(yīng)過程中反復(fù)高低溫設(shè)定，并且能夠?qū)崿F(xiàn)高溫高壓滅菌操作，常常被用于PCR耗材的生產(chǎn)。隨著熒光定量PCR技術(shù)的普及，該技術(shù)被廣泛用于遺傳、生化、免疫、醫(yī)藥等領(lǐng)域，不僅應(yīng)用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA，RNA的研究領(lǐng)域。

如何正確使用96孔PCR孔板

• PCR板有透明和乳白色可選，其中乳白色更適合用于頂部采集熒光信號的新型熒光定量PCR儀（如伯樂CFX系列，ABI 7500fast 以上型號， Roche 480系列），但如果熒光定量PCR儀是底部光源的，則應(yīng)選擇透明的。

• PCR板根據(jù)裙邊設(shè)計又可分為無裙邊、半裙邊和全裙邊三種設(shè)計模式，不同廠家的熒光定量PCR儀會設(shè)計不同的切角或邊緣凸起，請選擇適合該PCR儀的板子。

• PCR板又分100ul體積（矮板）和200ul體積（高板），根據(jù)機型的不同選擇，選擇不同高度孔板，避免高度錯誤對機器造成破壞和加熱不均導(dǎo)致數(shù)據(jù)失真。

• 當(dāng)使用96孔板做熒光定量PCR實驗的時候，推薦使用光學(xué)膜代來密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向，后沿著板的邊緣按壓使之密封。具體手法見下面圖示：

• 加樣后會在管壁上飛濺一些小液滴，另外反應(yīng)體系內(nèi)也會有一些氣泡，需要離心去掉掛壁液滴和氣泡。請使用的微孔板離心機解決上述問題。

• PCR板屬于一次性消耗品，生產(chǎn)一次成型，不建議剪開使用容易造成實驗誤差增加，不能清洗或部分重復(fù)利用。不要為了節(jié)省一點小錢，而給實驗帶來后續(xù)分析上的困擾。

樣本量少，用8聯(lián)管做實驗又該注意哪些呢？

• 8聯(lián)管也分乳白和透明兩種，選擇方式和孔板一樣，根據(jù)PCR儀的熒光信號采集方式?jīng)Q定。

• 8聯(lián)管同樣也有0.1ml（矮管）和0.2ml（高管），根據(jù)PCR儀的加熱模塊體積確定。

• 8聯(lián)管的蓋子一般有光學(xué)平蓋和凸型圓蓋之分，光學(xué)平蓋適用于熒光定量PCR，圓蓋適用于普通PCR。

• 使用單管或8聯(lián)管做實驗，并且樣本數(shù)量不多的時候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品，是縱向放置，并且優(yōu)先放在第6列或第7列，然后逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至于發(fā)生傾斜，各個反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性。也可以在加熱模塊四角的位置，放置4個單管平衡熱蓋壓力，避免擴增少量樣本時出現(xiàn)管子變形的情況。

• 管蓋沒有蓋好造成PCR反應(yīng)液熱蒸發(fā)，影響反應(yīng)溫度的準(zhǔn)確控制及反應(yīng)也各成份的濃度，同時也成為一個污染源。不但會因壓蓋時由于粗心或者用力不均致使部分蓋子變形，而且還會造成樣品的交叉污染，所以我們推薦用獨立管蓋的8聯(lián)管，每管蓋一體，確保樣本獨立反應(yīng)，避免交叉污染。