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在做qPCR實驗時，我們經常會問：“你是做定量還是相對定量呢？”，而定量方法的選擇是取決于實驗的目標。定量可測定目標核酸分子的實際拷貝數，但也是費力、復雜的定量形式。此方法要求周密的實驗方案和高度準確的標準曲線，常用于確定病毒滴度。
使用標準曲線進行定量
定量是通過樣品的Cq值和標準曲線進行比較實現的。首先為了建立標準曲線，需要已知拷貝數濃度的標準品，對標準品進行5次以上的連續(xù)梯度稀釋，將稀釋的標準品進行實時熒光定量PCR擴增，后根據各樣品的拷貝數濃度及相應的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標準曲線進行比較，確定其拷貝數濃度。
從圖1可以發(fā)現，當模板起始濃度越大時，熒光達到閾值的循環(huán)數越少，即Cq值越小。反之，模板起始濃度越小時，Cq值越大。起始模板量的Log值與循環(huán)數Cq值呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，即可確定未知待測樣本中目的基因的量。
如何選擇標準品？
如前所述，生成標準曲線采用的模板將決定數據的準確度。所以使用與實驗樣本盡可能類似的目標模板，可優(yōu)選有證的標準物質或參考物質。那么制備標準品的常見方法如下：
? DNA 標準品：目的靶點的PCR擴增片段或含有目的靶點的質?？寺。▓D2）。
優(yōu)點：易于生成、定量，可在適當的儲存條件下維持穩(wěn)定性。
缺點：無法進行qRT-PCR 的逆轉錄步驟，大大影響了反應效率。
PCR擴增片段：通過常規(guī)PCR進行目的片段擴增，回收純化PCR擴增片段，可直接作為標準品，相對于質粒，PCR擴增片段不是那么穩(wěn)定。
質?？寺。簩⒛康钠芜M行PCR擴增，回收目的條帶后連入T載體，再進行質粒提取，OD值定量，將質粒梯度稀釋作為標準品使用。
? RNA 標準品：目的靶點的體外轉錄RNA(圖3)
優(yōu)點：結合了RT效率，程度地模擬了目的靶點。
缺點：需要耗費時間生成該標準品，因其不穩(wěn)定，難以保持長期準確度。
體外轉錄RNA：利用實時熒光定量PCR生成的PCR 產物可利用包含5’ T7啟動子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆轉錄引物重新擴增。體外轉錄反應生成多聚腺苷酸化正義mRNA。純化后可將其準確定量并稀釋，用于生成標準曲線。
Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統——定量示例
•方法:從組織中提取基因組DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測
•試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)
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