PCR的基本原理

1概述
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，縮寫：PCR，又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。透過這項(xiàng)技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。

2 PCR原理
PCR技術(shù)的基本原理首先基于DNA半保留復(fù)制原理，還有堿基互補(bǔ)配對原則，即復(fù)制的過程中雙鏈DNA會(huì)解鏈，由雙鏈變成單鏈，溫度一般為95℃；之后溫度降下來，引物會(huì)結(jié)合到DNA單鏈上，在DNA聚合酶的作用下，把游離的dNTP按照堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合到單鏈上，形成一條由舊鏈和新鏈雜合成的新的雙鏈DNA。這個(gè)過程可概括為‘變性-退火-延伸’三個(gè)基本步驟。

一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

變性：利用高溫（94℃～98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長一些時(shí)間以確保模板和引物全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1～2分鐘，接下來機(jī)器就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

退火（又稱復(fù)性、降溫貼合、緩冷配對、引物黏合）：在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1～2分鐘。新技術(shù)的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會(huì)高于熔點(diǎn)3~5℃，僅需時(shí)間5~10秒。

延伸：DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000 bp大概需要1分鐘、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。有修正功能的則會(huì)比較慢。

3 PCR反應(yīng)體系表1 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

4 PCR反應(yīng)特點(diǎn)

4.1特異性強(qiáng)   
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。
4.2 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10^-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=10^-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
4.3簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，經(jīng)過變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
4.4 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。