原位PCR分類(lèi)

原位 PCR 技術(shù)(In situ PCR，Is PCR )是 Hasse 等人于 1990 年建立的技術(shù)，即在組織細(xì) 胞里進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，當(dāng)時(shí)稱為“細(xì)胞內(nèi) PCR"(in cell PCR)。它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的 原位雜交技術(shù)和高度特異敏感性的 PCR 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，能檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)單拷貝及低拷貝的靶 DNA 或 RNA。

該方法就是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片 段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。與原位雜 交相比，原位 PCR 技術(shù)大大提高了檢測(cè)的靈敏度。原位技術(shù)既可以分辯鑒定帶有靶序列的 細(xì)胞，又可以標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，對(duì)有效檢測(cè)各種病原菌和從分子及細(xì)胞水平上研 究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床轉(zhuǎn)歸過(guò)程具有重大的實(shí)用價(jià)值。

原位 PCR 技術(shù)作為一種病原體的檢測(cè)方法，其標(biāo)記物的類(lèi)型可分為兩種:非放射性標(biāo) 記法和放射性標(biāo)記法。非放射性標(biāo)記法包括如、生物素、過(guò)氧化物酶等，后者放射性 標(biāo)記法多采用放射性同位素 H3h 和 P32 等。

根據(jù)標(biāo)記物摻入方法的不同，原位 PCR 方法分為兩大類(lèi):即在反應(yīng)體系中使用標(biāo)記的 單核苷酸或引物的直接法原位 PCR(direct in situ PCR);所用引物和單核苷酸都不帶任何標(biāo)記 物，待反應(yīng)結(jié)束后再用原位雜交技術(shù)檢測(cè)特異性擴(kuò)增片段產(chǎn)物的間接法原位 PCR(indirect in situ PCR)。現(xiàn)在臨床上使用最多的是間接法原位 PCR，相對(duì)于直接法原位 PCR，它的特異 性更高。

另外還有一種叫做原位反轉(zhuǎn)錄 PCR 的原位擴(kuò)增方法是指在進(jìn)行 PCR 之前首*行 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程(RT)，將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物作為模板用于擴(kuò)增，這個(gè)過(guò)程叫做原位反轉(zhuǎn)錄 PCR(In situ reverse transcription PCR，簡(jiǎn)稱原位 RT-PCR)。近年出現(xiàn)的原位環(huán)式等溫?cái)U(kuò)增，即在 Is PCR 原理基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，穿透處理?xiàng)l件溫和，細(xì)胞不易破碎，設(shè)計(jì)的環(huán)狀引物使擴(kuò)增產(chǎn) 物分子量大，不易擴(kuò)散，擴(kuò)增溫度低且恒定，不使用 PCR 儀，細(xì)胞損失率大大降低。