多功能酶標(biāo)儀靈敏度影響因素探究

   ，對于靈敏度的描述，主要有“Sensitivity"和“Detection Limit"兩種說法,我們分別來看它們的定義：
       A: Detection Limit： 檢出限，這里有兩種理解：分析方法檢出限和儀器檢出限

       1.分析方法的檢出限：國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）對檢出限的規(guī)定：對各種光學(xué)分析方法，可測量的最小分析信號XL以下式表示：

• XL＝Xb+kSb

• 式中Xb―空白多次測定的平均值（n≥20）

• Sb－空白多次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差

• k－根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)（IUPAC規(guī)定k＝3，此時的置信水平為90%）。為了提高檢出限的可靠性，人們還提出了保證檢出限（Limit of Guaranteed Detection）的概念，也就是上述DL公式中k＝6時的檢出限。

       2.儀器檢出限：用于評價儀器的檢測能量，即：相對應(yīng)背景，儀器可靠檢測的最小信號，通常用信噪比S/N來表示，為S/N≥K,根據(jù)置信度概念，K可取2或3，為合理的賦予值。

       B: Sensitivity：靈敏度。對于靈敏度概念而言，在IUPAC的定義是：方法的靈敏度m表示被測組分濃度或含量改變一個單位時所引起的分析信號的變化，即m=dX/dc。其中X為分析信號，c為濃度或含量。在分析方法的校正曲線上，一般可以認為靈敏度就是分析校正曲線的斜率。曲線斜率越大，表示靈敏度越高。但在儀器參數(shù)中所說的“Sensitivity"并不是表示這一概念，而是具體指的是“DL（Detection Limit）或LOD（Limit Of Detection）"，比如BMG在Sensitivity的注解中就明確說明指的是“LOD"。如果上述（表中）參數(shù)描述的“Detection Limit"（Tecan/MD/PE）指的是“方法檢出限"且“Sensitivity"(BMG/Bio-Tek/Thermo)指的是“LOD"時，則Sensitivity＝LOD＝DL＝Detection Limit。雖然描述詞不同，但是概念是相同的，其參數(shù)可以直接比較。

       目前從各廠家公開的資料中，只有BMG明確說明采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）的檢測標(biāo)準(zhǔn)去例明參數(shù)。也只有BMG公司在參數(shù)中明確寫明了其Sensitivity的定義，包括定義、詳細的測定條件等。例如在BMG最新推遲的高性能漸變?yōu)V片型光柵多功能酶標(biāo)儀CLARIOstar的參數(shù)描述中，其FI（熒光）頂讀的靈敏度為FI Filters (top) < 0.4 pM (< 8 amol/well Fluorescein, 384sv, 20 μL)，就在參數(shù)后面明確寫明了測試靈敏度時的方法：采用熒光素（Fluorescein）為底物做6點的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用的是384 Small Volume微孔板，20μL的檢測體系。這里要清楚知道，測定參數(shù)時采用的微孔板類型以及檢測體系的體積非常重要。因為不同的條件，其靈敏度計算結(jié)果是不一樣的。下面表2為各酶標(biāo)儀廠家的網(wǎng)站的參數(shù)資料：

      每個廠家都有不同的標(biāo)準(zhǔn)去定出其檢測靈敏度。一般會把所用的檢測濃度和質(zhì)量寫出來，但也有些廠家或型號只例出濃度單位，例如：Bio-Tek Neo，MD SpectraMax M5/M3等。要全面比較檢測靈敏度，其實要配合濃度、質(zhì)量和檢測體積幾個要數(shù)作考慮。如果只有濃度(M)，那實際檢測的體積是多少?200μl?100μl或是20μl?不同的體積會使實際檢測的質(zhì)量不同，這可以是十倍或更多的差別。

       除此之外，統(tǒng)一性的檢測標(biāo)準(zhǔn)也很重要。例如：BMG所有型號的頂讀熒光每次都會用384 small volume微孔板，并以20μl的體積進行檢測。從表2中可以看到由中端研究型的FLUOstar Omega到  的PHERAstar FS都是用統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)去量度和顯示其靈敏度。如果型號間的檢測標(biāo)準(zhǔn)不一，如Tecan入門型號F200和高型號F500的參數(shù)，前者是用100μl做出的；后者是用10μl做出的。這樣用戶會發(fā)現(xiàn)一個有趣現(xiàn)象 – 就是單看濃度，F(xiàn)200（0.85pM）入門型好像比F500（1pM）高 型號更靈敏！當(dāng)然用戶也會有疑問，為什么較低端F200比 的F500要多用10倍體積？大家同樣是384孔板，為什么檢測的體積標(biāo)準(zhǔn)不一樣呢？那是否那100μl做出來的參數(shù)用20μl時可以做出同樣的靈敏度(85 amol)？這相信值得用家去思考一下。

       BMG的所有參數(shù)是根據(jù)IUPAC標(biāo)準(zhǔn)去檢測出來，所用的方法、體積、微孔板、濃度和質(zhì)量等，都清楚例明。在384孔板中一貫采用20μl體積是因為這是接近實際實驗的情況。有些廠家所用的檢測體積與現(xiàn)實情況其實有差距，例如Biotek的Synergy 2熒光參數(shù)標(biāo)示為：“Fluorescein 1 pM typical (0.1 fmol/well 384-well plate) – Top"，雖然廠家沒有寫出來，但只要小心計算，可得出384孔板時的參數(shù)是用100μl的體積去做檢測。實際上，市場上的384孔板的每孔體積一般只有約110μl (例如：CORNING)，而微孔板廠家推薦使用體積為20μl -80μl。如果用100μl去做檢測是有點不太現(xiàn)實，因為體積太滿會令孔內(nèi)液體在檢測移動過程中比較容易淺出，這也使孔板在實驗過程中無法使用振動功能去搖勻孔內(nèi)的樣本，影響檢測結(jié)果。再者，使用384孔板的原因除了因為高通量外，更重要的是想用更小的樣本和試劑體積。如果在384孔板上要用到100μl的試劑樣本，那跟原來想節(jié)省成本的原意就背道而馳了。當(dāng)然，檢測體積愈小，對儀器的檢測靈敏度要求愈高，對廠家挑戰(zhàn)也愈大。但BMG寧可放棄用較大體積做出來的漂亮參數(shù)，也要忠于實際操作，用小體積做出參數(shù)給客戶參考。事實上，即使是BMG最入門的Optima系列的化學(xué)發(fā)光和熒光酶標(biāo)儀，也被客戶用來發(fā)表了超過110份Nature或Nature Publishing Group的文章，其優(yōu)良的性能實際是不容懷疑。

       綜合以上各方面，在對酶標(biāo)儀的參數(shù)進行對比時，單位的統(tǒng)一非常重要，同時測定參數(shù)時采用的條件同樣重要。對于眾多廠家的儀器，其實很難用一個 一樣的方法去比較，因為不同廠家所用的條件都不一樣。畢竟儀器的性能和表現(xiàn)是要用家使用出來，而不只是靠把參數(shù)寫得漂亮。