1、取組織塊(0.2g~1g)最少可到2~5mg,在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,放入5或10ml的小燒杯內(nèi)
2、用移液管量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化鈉溶液)或者用0.86%冷生理鹽水,勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍,用移液管或移液器取總量的2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天然時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行,將盛有組織的小燒杯放入冰水中)。
3、勻漿的方式有多種:手工勻漿、機(jī)器勻漿、超聲勻漿、反復(fù)凍融。
手工勻漿:將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿,左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次(6~8分鐘),充分研碎,使組織勻漿化。
機(jī)器勻漿:用組織研磨機(jī)(OMNIBead Ruptor 24 多樣品研磨珠均質(zhì)儀) 6m/s研磨制成10%組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備(Omni Prep 多樣品均質(zhì)儀 )勻漿時(shí)間20秒/次,間隙10秒,連續(xù)3-5次。
超聲粉碎:用超聲波細(xì)胞破碎儀(OMNI Sonic Ruptor400W)進(jìn)行破碎,可用以振幅12.7mm超聲處理30秒使細(xì)胞破碎.
反復(fù)凍融:培養(yǎng)或者分離的細(xì)胞可以用以上的方法勻漿,也可以反復(fù)凍溶3次左右(即讓細(xì)胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰,溶解,再結(jié)冰,再溶解,反復(fù)3次左右),但有部分酶活力會受影響。
取少量組織勻漿做涂片(直接涂片、染色均可),顯微鏡下觀察細(xì)胞是否磨破,若沒有破則可以延長勻漿時(shí)間或增加凍融次數(shù)。
4、將制備好的10%勻漿用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)3000r/min左右離心10~15分鐘,若檢測ATP酶,則只需要1000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,將離心好的勻漿留下上清棄下面沉淀。
根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要,取適量上清夜進(jìn)行各種測定。