scarabgenomics C-0742說(shuō)明書(shū)

MDS™42 Chemically Competent Cell Kit

• 維持和繁殖不穩(wěn)定的克隆和質(zhì)粒 - 攜帶直接重復(fù)序列，反向重復(fù)序列或?qū)е旅黠@的二級(jí)“莖 - 環(huán)”結(jié)構(gòu)的其他序列的pDNA載體在標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌宿主中通常是不穩(wěn)定的。CleanGenome® 大腸桿菌菌株經(jīng)常用于克隆在其他菌株中遭受不需要的重組事件的序列。
• 準(zhǔn)確的質(zhì)粒復(fù)制 - 從CleanGenome® 大腸桿菌菌株中刪除了重組或移動(dòng)DNA元件，如插入元件，以確保您的構(gòu)建體的忠實(shí)復(fù)制。
• 克隆和表達(dá)“有害”基因 - 清除Genome® 大腸桿菌菌株的自然防御系統(tǒng)，例如IS變異“有害”基因以阻止對(duì)生物體的壓力，已被刪除，因此它們不會(huì)干擾您的實(shí)驗(yàn)。

背景

使用合成生物學(xué)方法，通過(guò)進(jìn)行一系列計(jì)劃的，的缺失來(lái)減少大腸桿菌K-12基因組。多重缺失系列（MDS™）菌株（1），基因組減少高達(dá)15％，通過(guò)鑒定非必需基因和消除序列，包括重組或移動(dòng)DNA和神秘毒力基因，同時(shí)保持強(qiáng)勁生長(zhǎng)而設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)?；蚪M減少還導(dǎo)致意想不到的有益特性，包括高電穿孔效率和重組基因和在其他菌株中不穩(wěn)定的質(zhì)粒的準(zhǔn)確繁殖。隨后的缺失和有用等位基因的引入產(chǎn)生適合于許多分子生物學(xué)應(yīng)用的菌株。

圖1：多個(gè)缺失菌株耐受“有害”基因。 
由霍亂毒素B亞單位（CTX）融合的兔出血癥病毒VP60組成的嵌合基因在大腸桿菌中非常不穩(wěn)定。單獨(dú)地，兩個(gè)基因在E中都是穩(wěn)定的。大腸桿菌HB101，C600和DH10B，但在相同宿主中攜帶融合基因的pCTXVP60不產(chǎn)生融合蛋白，并且以低產(chǎn)率回收。所有回收的質(zhì)粒都含有CTXVP60開(kāi)放閱讀框中的突變，幾乎全部來(lái)自IS插入。相反，重組質(zhì)粒在MDS TM中*穩(wěn)定; 獲得了正常的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量。pCTXVP60的代表性限制性模式。（A）將來(lái)自MDS TM 42的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化并在的宿主中繁殖，然后用NcoI和EcoRI消化。純化每個(gè)限制性模式的代表并測(cè)序。M，分子量標(biāo)記，1 kbp階梯; 1，MDS™41，無(wú)插入; 2，MDS™42，無(wú)插入; 3，DH10B，IS 10插入; 4，DH10B，IS 10插入/缺失; 5，C600，IS5插入; 6，C600，IS1插入; 7，C600，IS 1插入。（B）對(duì)于所呈現(xiàn)的五個(gè)實(shí)例確定的CTXVP60閱讀框中IS元件插入位點(diǎn)的相對(duì)位置。

圖2：不同宿主菌株中的質(zhì)粒穩(wěn)定性。 
左：在pT-ITR的四次傳代培養(yǎng)期間，具有病毒LTR區(qū)段的質(zhì)粒; 泳道0，傳代培養(yǎng)前分離的質(zhì)粒DNA，泳道1-4，連續(xù)傳代培養(yǎng)。用限制酶消化質(zhì)粒DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析。KpnI在單個(gè)位點(diǎn)切割質(zhì)粒，但在MG1655中，兩個(gè)條帶表明質(zhì)粒缺失。MscI在兩個(gè)位置切割，但在MG1655中，第三個(gè)中間帶確認(rèn)質(zhì)粒被刪除。右圖：慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的四種變體在MDS TM42ΔrecA和Stbl3 TM（Life Technologies）中的穩(wěn)定性，顯示含有完整質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體的比例（表2 BioTechniques 43：466-470（2007年10月））（2）。

試劑盒組分 
MDS™42個(gè)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞
的pUC19對(duì)照DNA（10微克/微升）
的SOC培養(yǎng)基

基因型 
MG1655多缺失菌株（1）
所述的recA基因 1819突變是Δ的*缺失的recA。
已經(jīng)在基因組中產(chǎn)生了lacZ M15缺失，以允許使用β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)片段對(duì)質(zhì)粒中的插入物進(jìn)行藍(lán)/白篩選。

質(zhì)量控制 
使用pUC19對(duì)照DNA測(cè)試轉(zhuǎn)化效率，一式兩份進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞接種在含有50μg/ ml羧芐青霉素的LB平板上。轉(zhuǎn)化效率= 1×10 ⁸cfu /μgDNA。

儲(chǔ)藏條件 
將組件儲(chǔ)存在-80°C。不要將細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中。

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