制備平行膠時如何正確使用梯度生成器/梯度計/梯度生成儀步驟和方法簡述

制備平行膠時如何正確使用梯度生成器/梯度計/梯度生成儀步驟和方法簡述

平行膠中從上至下變性劑的濃度遞增。這種膠適用于分析大量樣品。

1)與制備標(biāo)準(zhǔn)聚丙烯胺凝膠一樣制備膠板。

2)從丙烯酰胺和兩種變性劑貯存液中取兩份等體積溶液以符合要求的變性劑濃度范圍。溶液的總體積一般為剛好覆蓋膠板。丙烯酰胺的濃度取決于DNA 的大小，對于DNA 大小為≥300bp 的丙烯酰胺的濃度為6%，而長度＜300bp 的DNA ，丙烯酰胺的濃度為12%。

3)加高濃度變性劑溶液到合肥橋斯梯度生成器/梯度計/梯度生成儀右槽中(該溶液將首先通過梯度合成器進(jìn)入膠板間的空隙)，打開連接梯度生成器/梯度計/梯度生成儀兩端的開關(guān)，讓一些溶液流入左槽內(nèi)關(guān)上開關(guān)，用吸管把它們移回到右槽(目的是確保兩槽之間無氣泡的阻隔)。然后把低濃度變性劑溶液加到梯度生成器/梯度計/梯度生成儀左槽中。

4)攪拌這兩個槽中溶液的同時向其中加入4.5μL/mLl0%的過硫酸銨和1μL/mL 的TEMED(N，N，N'，N'，—四甲基乙二胺)。

5)輕輕打開兩槽之間的開關(guān)及梯度生成器/梯度計/梯度生成儀出口的開關(guān)，灌膠時兩槽內(nèi)的溶液應(yīng)處于攪拌狀態(tài)(尤其高濃度溶液槽更應(yīng)攪拌)，溶液受重力影響通過一個放在兩塊玻璃板之間的頂部的細(xì)塑料管流過梯度生成器/梯度計/梯度生成儀。流速應(yīng)保持一定大小以保證溶液在凝聚之前所有溶液都應(yīng)注入到兩層玻璃板之間。(凝聚速度可通過調(diào)整過硫酸銨和TEMED 的濃度來調(diào)節(jié))。

6)膠板充滿后，在其頂部插入梳子并將其放平，凝聚至少30min。(膠可事先灌好并于4℃貯存幾天)。

合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的梯度生成器/梯度計/梯度生成儀構(gòu)造簡單，裝配簡易，梯度性能好，有不同規(guī)格備選：RDY-TD15，RDY-TD25，RDY-TD35小型梯度生成器適于采用蔗糖或氯化銫溶液制備離心梯度。RDY-TD50，RDY-TD100（可替代美國Bio-rad伯樂485 型梯度生成儀）大型梯度生成器主要適用于制備線性梯度聚丙烯酰胺凝膠。

梯度生成器/梯度計/梯度生成儀均由雙腔體組成，一個為蓄存腔，一個為混合腔，備有一互通閥，第二個閥門調(diào)控混合腔輸出流量。混合腔中置一磁力攪拌棒以確保恒定梯度。所有梯度生成器底部平坦，可放置到磁力攪拌器上。