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以DIG 標定核酸探針

2012-7-16  閱讀(1442)

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DNA探針一般可以用32P, 35S或非放射性物質(zhì)如biotin及digoxigenin (DIG) 加以標定;標定時利用DNA聚合酶的活性,在DNA聚合反應(yīng)中,另加入 [α-32P] dATP,[α-32P] dCTP或DIG-11-dUTP等標定物質(zhì),所合成出來的即是被標定的核酸片段。目前常見的方法包括nick translation, random priming與polymerase chain reaction(PCR) 等。 若須對DNA進行end labeling時,可以進行kinase或filling-in reaction。

 
    前者以 [γ-32P] ATP為phosphate donor,利用T4 polynucleotide kinase的活性對帶有5’-OH的DNA進行標定。人工合成的寡核苷酸 (oligonucleotides) 5’端為-OH group,可直接用于kinase reaction;一般DNA片段,若5’端帶有phosphate group,先經(jīng)phosphatase處理,再進行kinase reaction。 Filling-in reaction是將DNA以特定限制酶切開,露出recessed 3’ termini后,利用Klenow的活性把3’端補齊 (filling-in);因此,只要加入適當?shù)?[α-32P] dNTP,即可在DNA的3’端進行標定。
 
    此外,也可以應(yīng)用bacteriophage T4 DNA polymerase 的3’→5’ exonuclease 活性制造recessed 3’termini,再進行filling-in。 至于正意股或反意股RNA探針,則可以 [α-32P] UTP或DIG-11-UTP等為標定物質(zhì),應(yīng)用胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)加以標定。 下面要介紹的是目前zui常用的方法:random priming及PCR。

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