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上海寶葉生物科技有限公司
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- www.shjsbio.com
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[器材和試劑]
●NcoI和NotⅠ限制性酶以及廠商的緩沖液3（New England Biolabs）（NEB3緩沖液）
●100×乙?；Ｑ宓鞍祝˙SA）（New England Biolabs，與NotⅠ一起提供）
●37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱器
●GelleClean試劑盒（Qbiogene，Inc．）
●pHENl DNAL8），氯化銫純化制備
●再擴(kuò)增的scFv基因文庫
[方法]
1，配制兩個100ul PCR反應(yīng)混合液來消化scFV文庫，其中1個用于VH-VκscFv文庫，另1個用于VH-Vλ scFv文庫，該混合液含有：
●scFV DNA（1～4ug），50ul
●水，33ul
●10×NEB 3緩沖液，10ul
●乙酰BSA（100×），1．0ul
●Nco工（10U/ul），3．0f11
●NoJ工（10U/ul），3．0ul
2．37℃孵育反應(yīng)液過夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置，防止水分蒸發(fā)?；蛘?，可以按PCR反應(yīng)那樣加一層礦物油（Sigma）。
3．用1%瓊脂糖膠純化基因文庫，并用Geneclean試劑盒提取DNA。重懸產(chǎn)物于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中，與已知大小和濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品比較，測定DNA濃度。
4．消化4ug氯化銫純化的pHENl DNA以準(zhǔn)備載體，其過程*如上述消化scFv基因文庫的流程，但須將scFvDNA替換為質(zhì)粒DNA②。
5．用0．8%瓊脂糖膠純化已消化的載體DNA，再按處理scFv插入序列的方式，用Gene-clean自膠中提取載體片段。將產(chǎn)物重懸于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中，與已知大小和濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品比較，測定DNA濃度。
