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蛋白質(zhì)定量分析

2012-7-16　　閱讀(1160)

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Bradford 的dye-binding method 是利用Coomassie brilliant blue G-250 （CBG） 可與蛋白質(zhì)結(jié)合而變色的特性來(lái)定量 （Bradford, 1976）；若試樣中的蛋白質(zhì)量較多，則結(jié)合到蛋白質(zhì)而變色的CBG 也多，因而呈色較深。下例是以一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為對(duì)象，制作一條蛋白質(zhì)量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)校正線(xiàn)。

儀器用具：ELISA光度計(jì) （Dynatech） 可在一分鐘內(nèi)測(cè)完一片滴定盤(pán)微量滴定盤(pán) （microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404）Micro test tubes, 大頭針或噴火槍
藥品試劑：（a） Buffer A-0（b） BSA標(biāo)準(zhǔn)品 （Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/mL）（c） 未知濃度樣本 （unknown BSA, 0.8 mL, 由教師調(diào)配發(fā)給）（d） Dye Reagent （Bio-Rad 500-0006） 先以水稀釋四倍備用。 以染料Coomassie brilliant blue G-250 配制的溶液，勿與膠體電泳染色用的CBR-250 混淆，各有其使用上的特色，不要互用。
    標(biāo)準(zhǔn)品及樣本：
    標(biāo)準(zhǔn)品系列：使用小試管準(zhǔn)備一組BSA （b） 標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋?zhuān)?/div>
    ◆ 配制一定要精準(zhǔn)，否則校正直線(xiàn)不會(huì)很準(zhǔn)確；各種試劑的添加，若自稀往濃取樣，則可以不用換吸管頭。
    未知樣本：再以上述unknown BSA （c） 準(zhǔn)備兩種未知樣本：Label 未知樣本 （c） Buffer A-0 Final Conc.
    一般樣本：1） 通常由色析法所收集到的各分劃樣本，都可以直接進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析；但若其中含有某些干擾因子 （如含有Triton），或樣本的濃度太濃，都必須將樣本稀釋后再測(cè)。2） 同一樣本的若干不同稀釋濃度，所測(cè)出來(lái)的zui終蛋白質(zhì)濃度會(huì)有差異，通常是以稀釋度大者較為準(zhǔn)確。
    方法步驟：
1）   每槽先加好50 μL標(biāo)準(zhǔn)品 （#0, #1 .... #5） 或未知樣本 （X1, X2），以二重復(fù)加入96 孔滴定盤(pán)中，如圖所示。
微量滴定盤(pán)的使用
2） 每槽再加入200 μL Dye-Reagent （d），在全部樣本槽加完前，不要中斷添加；同時(shí)小心避免氣泡產(chǎn)生。
3） 輕拍滴定盤(pán)一側(cè)，使添加的各成份均勻混合，注意Dye-Reagent 密度較大，很容易沉積在下方而分層。 若還有小氣泡，小心以大頭針刺破，大量時(shí)可用噴火槍火焰燒破。
4） 靜置室溫10 min。
5） 以ELISA reader測(cè)量570 nm （或595 nm） 的吸光值。

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