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上海寶葉生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·5年您現(xiàn)在的位置： 首頁> 公司動(dòng)態(tài)> Topl0F’細(xì)胞中的電轉(zhuǎn)化及文庫儲(chǔ)存
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- 上海市嘉定區(qū)新源路155弄
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[方法]
1．加2～3ul純化的連接反應(yīng)物（zui大值為0.3ug DNA）到80ul的*0F’電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖晃混合。使用30ng（2ul）的pUCl9控制電轉(zhuǎn)化效率。
2．將細(xì)胞+DNA懸浮液轉(zhuǎn)移到已冷卻的0．2 cm細(xì)胞電轉(zhuǎn)化管，并冰浴3分鐘。
3，將Gene Pulser Plus電穿孔儀設(shè)置為2．5kV脈沖，電容器設(shè)為25uF，脈沖控制器設(shè)為200ns。
4．用紙巾干燥電轉(zhuǎn)化管，然后將它放在電轉(zhuǎn)化箱中，使用一個(gè)脈沖（寄存時(shí)間常量必須為4．5～5．0毫秒）。
5．立即加lmlLB到電擊管中，打散細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml聚丙烯試管中。
6．在37℃下振蕩，使細(xì)胞能夠表達(dá)抗抗生素的標(biāo)記。
7．組合所有的電轉(zhuǎn)化樣品，通過100ul適當(dāng)稀釋后均勻地倒在小LBAT平板上來確定文庫的大小，用pUCl9控制電轉(zhuǎn)化能產(chǎn)生大約3×107的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
8．在20℃，2500g下旋轉(zhuǎn)組合電轉(zhuǎn)化樣品15分鐘，在0．5XLBAT起始體積中打散沉淀顆粒，將1 ml細(xì)胞懸浮液涂抹在每一平方LBAT平板上。
9．在37℃過夜孵育該板。
10．在每個(gè)平方板上灑上10ml LBAT以獲得文庫，，用無菌延輾機(jī)敲碎細(xì)胞，將已打散的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml聚丙烯試管中。
11．重復(fù)實(shí)驗(yàn)方案12．10，用5m1 LBAT除去板上留下的細(xì)胞。
12．在600nm測量細(xì)胞懸浮液的光密度（OD），如果有必要，可以將濃縮的細(xì)胞系稀釋到每毫升LBAT 40 OD600nm單位。
13．制備甘油菌，將5ml的甘油加到5ml的濃縮細(xì)胞系中，混合后均等地分到1m1聚丙烯冷凍管中，在-70℃冷凍及儲(chǔ)存，zui后細(xì)胞濃度將是每毫升20 OD600nm位，這大約是每毫升1．6×1010個(gè)細(xì)胞。
