Western Blot（WB）又名Western Bloting、Western、蛋白質(zhì)印跡法、免疫印跡試驗(yàn)，Western Blot 基本原理：首先利用SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的膜就稱為一個(gè)印跡（blot）,用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。印跡首先用蛋白溶液處理以封閉膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過(guò)的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。

     WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果背景過(guò)高可能是由很多因素引起的：封閉不*、顯色過(guò)度、洗滌不充分、轉(zhuǎn)移緩沖液或設(shè)備有污染、抗體稀釋度不對(duì)或抗體不純。

1、 封閉不*

一抗或二抗只要結(jié)合到膜上，就會(huì)顯色。為了避免非特異性的結(jié)合，應(yīng)用封閉液孵育膜，使所有的空白位點(diǎn)都被封閉蛋白占有。NC膜推薦封閉液是3%的明膠，室溫孵育1小時(shí)。如果想要低溫封閉的話，可以用3%的BSA。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。

傳統(tǒng)的牛奶/蛋白類封閉劑會(huì)形成較厚的、粘粘的蛋白層，導(dǎo)致與抗體發(fā)生非特異性相互作用，增加背景；另一方面，牛奶中本身含有的磷酸化蛋白會(huì)干擾蛋白磷酸化檢測(cè)。

2、顯色過(guò)度

顯色時(shí)間的長(zhǎng)短取決于蛋白條帶的數(shù)目以及你想要的靈敏度。如果膜在顯色液中放置太久，背景就會(huì)偏高。應(yīng)當(dāng)在蛋白條帶清晰可見(jiàn)，而背景幾乎沒(méi)有或很少時(shí)，將膜及時(shí)取出。

3、 洗滌不充分

在封閉以及抗體孵育之后，至少要洗兩次膜，每次5分鐘。去污劑的濃度不要太高，否則會(huì)把抗原從膜上洗下來(lái)。

4、 轉(zhuǎn)移緩沖液或設(shè)備污染

使用清潔劑將轉(zhuǎn)印槽內(nèi)外*清洗干凈，海綿墊也一定要認(rèn)真清洗，臟的海綿墊通常是污染的最主要原因。另外，每次轉(zhuǎn)膜時(shí)的緩沖液都要是新鮮配制的。

5、 抗體稀釋度不正確

一抗的稀釋度應(yīng)根據(jù)抗體來(lái)源和經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定。一般來(lái)說(shuō)，以1:100-1:1000來(lái)稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來(lái)稀釋腹水或超免疫動(dòng)物的血清。抗體稀釋度不夠，會(huì)產(chǎn)生非特異的結(jié)合，帶來(lái)高背景。

6、 二抗不純

沒(méi)有交叉吸附過(guò)的二抗可能會(huì)與膜上的其他蛋白相互作用，產(chǎn)生雜帶。這種情況可以選用單克隆的二抗。