引物，在核苷酸聚合作用的起始時(shí)，可以刺激合成另一種大分子，并與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接的序列。在核酸化學(xué)中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈。無論是做普通PCR還是熒光定量(Real time)PCR，設(shè)計(jì)合適的引物是非常關(guān)鍵的一步。
普通PCR和熒光定量PCR的檢測(cè)方式具有較大的差別。熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光，普通PCR通過檢測(cè)插入DNA中核酸染料的量來測(cè)定PCR最終產(chǎn)物量。熒光定量PCR可以通過擴(kuò)增曲線進(jìn)行精確定量，普通PCR則是通過電泳的方式進(jìn)行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)方面，有什么相同和不同處呢？

相同處：
1、序列的查找是一致的；
2、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；
3、選取合適的擴(kuò)增片段大小
4、避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)；
5、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
6、Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
7、引物之間的TM相差避免超過2℃；
8、引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基；

不同處：
Real time PCR 引物
1、PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度；real-time PCR要求在300bp以內(nèi)，一般選80-150bp 之間；
2、多對(duì)目的基因同時(shí)擴(kuò)增，文獻(xiàn)上查來的引物條件會(huì)不同，需要設(shè)計(jì)盡可能條件一致的引物；
3、目的基因含量比較低時(shí)，需要設(shè)計(jì)靈敏度比較高的引物；
4、相對(duì)電泳法，Real time PCR靈敏度比較高，對(duì)引物的要求更高，引物二聚體要少；熔解曲線要求單一產(chǎn)物；
5、Real time PCR的目的是進(jìn)行定量或者相對(duì)定量，對(duì)擴(kuò)增的效率有要求；對(duì)引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)要求高；

普通PCR 引物：
1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求不同，長(zhǎng)度一般是從150bp到幾千bp 不等；
2、對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)要求沒有real time PCR 高；
3、對(duì)擴(kuò)增效率要求不高；
4、可以選用梯度PCR 儀，選擇不同退火溫度，對(duì)引物退火溫度要求不需要一致；

驗(yàn)證時(shí)不同：
引物的特異性（相同點(diǎn)）：
引物的特異性在使用前用blast 來保證；

不同點(diǎn)：real time PCR
在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中通過熔解曲線來驗(yàn)證；
PCR的特異性產(chǎn)物峰應(yīng)與引物報(bào)告中的PCR product 相差在兩度之內(nèi)；

普通PCR 通過產(chǎn)物的長(zhǎng)度，跑條帶，來鑒別產(chǎn)物的特異性；
Real time PCR 可以通過擴(kuò)增曲線，熔解曲線分析來鑒別產(chǎn)物的相對(duì)量，同時(shí)也可以對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，更全面，更科學(xué)！