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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)過程詳解

閱讀:135          發(fā)布時(shí)間:2024-11-18

      逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)可以:(1)分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;(2)獲取目的基因;(3)合成cDNA探針;(4)構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)方法原理:

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、總RNA的提取
總RNA提取可以:(1)獲得高純度、高質(zhì)量的總RNA;(2)可以滿足生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)Northern Blot、核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、qRT-PCR 和陣列分析所需。

二、cDNA第一鏈的合成
目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。現(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

1. 在0.5 ml微量離心管中,加入總RNA 1-5 μg,補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11 μl。在管中加10 μM Oligo(dT)12-18 1 μl,輕輕混勻、離心;

2.70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min;

3. 取0.5 ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA 2 μl;上游引物(10 pM) 2 μl;下游引物(10 pM) 2 μl;dNTP(2mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl) 1 μl。輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5 min;
4.加入SuperscriptⅡ1 μl ,在42℃水浴中孵育50 min;

5. 于70℃加熱15 min以終止反應(yīng);

6.將管插入冰中,加入RNase H 1 μl ,37℃孵育20 min,降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>

三、PCR
1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA   2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;

2.加入適量的ddH2O,使總體積達(dá)50 μl。輕輕混勻,離心;

3.設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確,可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí),加入一對內(nèi)參(如G3PD)的特異性引物,同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA,作為對照;

4.電泳鑒定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果;

5.密度掃描、結(jié)果分析:采用凝膠圖像分析系統(tǒng),對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

注意事項(xiàng):

1.在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂;

2. 為了防止非特異性擴(kuò)增,必須設(shè)陰性對照;

3.內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動(dòng)蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;

4. PCR不能進(jìn)入平臺期,出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定;

5. 防止DNA的污染: 采用DNA酶處理RNA; 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。


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