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固相抗體型ELISA試劑盒

閱讀:466          發(fā)布時(shí)間:2014-8-4

固相抗體型ELISA試劑盒

    由于前者操作上欠安全等原因,目前常采用后一種類型。在ELISA試劑盒中,抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)依靠酶標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn),常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標(biāo)記激素分子,稱為酶標(biāo)植物激素,也可標(biāo)記于第二抗體(識(shí)別抗激素抗體Fc片段的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白),稱為酶標(biāo)二抗。這兩類標(biāo)記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。

    A.固相抗體型ELISA試劑盒:將抗激素的單克隆抗體(Mab)與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體(RAMIG)結(jié)合,然后加入激素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品,使其與固相化的Mab結(jié)合, 再加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記激素(酶標(biāo)激素)。通過(guò)測(cè)定酶標(biāo)激素的被結(jié)合量,可換算出未知樣品中激素的數(shù)量。B.固相抗原型ELISA試劑盒:將“激素-蛋白”復(fù)合物(該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白)包被于固相載體,加入待測(cè)激素(樣品或標(biāo)準(zhǔn)品)和抗IAA多克隆抗體(Pab)反應(yīng),進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。然后讓HRP標(biāo)記羊抗兔Ig抗體(HRP-GARIG)與結(jié)合在固相上的Pab反應(yīng),通過(guò)測(cè)定與固相結(jié)合的酶量,換算出未知樣品中激素的含量。
(一)材料:高等植物、真菌、藻類等組織或器官。
(二)儀器設(shè)備:1. 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀;2. 高速冷凍離心機(jī);3. 恒溫箱;4. 連續(xù)進(jìn)樣器;5. 渦旋儀;6. 96孔微孔板;7. 離心管;8. 研缽或勻漿器;9. 試管。
(三)ELISA試劑盒試劑1. 洗滌緩沖液:0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液(PBS),含0.05%Tween-0;2. RAMIG溶液,或“激素-蛋白”復(fù)合物;3. 0.1%封閉蛋白(該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5. 激素標(biāo)準(zhǔn)品母液,及參比系列溶液(按雙倍或四倍系列稀釋);6. HRP標(biāo)記激素,或HRP-GARIG;7. 鄰苯二胺(OPD)基質(zhì)液:5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS,用前加入30%H2O212.5μl。
三、實(shí)驗(yàn)步驟 
1. 用方陣法滴定選擇各反應(yīng)物zui適工作濃度;
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔,4℃濕盒,12h;
3. 棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
4. 加入100μl抗激素Mab溶液,37℃70min;

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