石蠟切片制備基本步驟

                                      

一、準備工作

（一）洗滌實驗所需器皿：（玻璃器皿的清洗）

1、  用洗衣粉將玻璃器皿表里擦洗干凈反復(fù)洗刷

2、  將器皿在自來水下沖洗干凈

3、  將器皿倒扣在鋪有吸水紙或紗布的桌子上控干

注：一般情況下，經(jīng)以上步驟后，用蒸餾水洗過1~3次即可烘干備用，如果做特殊染色還需浸泡在酸性清潔液內(nèi)12~24小時，再經(jīng)自來水*沖洗，再用蒸餾水過洗1~3次 烘干備用。

（三）載玻片與蓋玻片的處理

1.        將所需載玻片與蓋玻片清洗后，放入硫酸重鉻酸鉀溶液中浸泡24小時

2.        流水沖洗，再用蒸餾水沖洗3遍

3.        95%~100%酒精浸泡24小時，用綢布擦干備用

注：在將載玻片與蓋玻片放入清潔液中時，要一片片地投入，使其不致重疊。

 

二、常用液體的配制

（一）緩沖溶液：

1．磷酸鹽緩沖液

A液：0.1mol/L磷酸二氫鈉

B液：0.1mol/L磷酸氫二鈉

A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）

2．枸椽酸緩沖溶液

A液：0.1mol/L枸椽酸

B液：0.1mol/L枸椽酸鈉

A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）

（二）固定劑：

1．甲醛：10%甲醛

福爾馬林    100ml

蒸餾水      900ml

注：實際甲醛含量只有3.6~4.0%但習(xí)慣上都將其視為10%。

2．10％中性福爾馬林鈣固定液

甲醛液    10ml

蒸餾水    90ml

加碳酸鈣至過飽和(以容器底部碳酸鈣沉淀1~2cm厚為適度)充分振蕩混合后，放置24小時取上清液使用。

3．4%多聚甲醛：

8%多聚甲醛

多聚甲醛   8g

蒸餾水    100ml

加溫至60℃左右，不時攪拌，成為乳白色溶液。滴加1N NaOH，并不停攪動至液體清明。

1N NaOH

lN等于1L溶液中某種物質(zhì)1mol除以該物質(zhì)的氫當量價所得數(shù)值的量

氧化鈉(NaOH )；分子量＝40．005，當量價＝1

1N Na0H的配制方法為：m＝40．005／1＝40．005g。取40．005gNaOH溶解于1L蒸餾水中

4%多聚甲醛

8%多聚甲醛         50ml

0.1M磷酸鹽緩沖液   50ml

PH7.2

先取50 ml 8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氫鈉和0.1M磷酸氫二鈉將PH值調(diào)至7.2

6．Carnoy液：

冰醋酸     10 m1

無水乙醇   60 m1

以上三者臨用前混合，預(yù)冷至4℃后使用。24小時后固定液失效。

（三）染色液

1．Harris蘇木精液

A液：

蘇木精          1g

*        10ml

B液：

銨礬或鉀礬      20g

蒸餾水          200ml

冰醋酸          8ml

2．Mayer蘇木精掖

蘇木精         1g

鉀礬或銨礬     50g

碘酸鈉         0.2g

蒸餾水         1000ml

水合氯醛       50g

枸櫞酸         1g

將蘇木精，鉀礬及碘酸鈉依次加入水內(nèi)，略加熱并攪拌，此時液體呈藍色，待全溶后過夜。再加入水合氯醛及枸櫞酸并加熱至煮沸5分鐘，冷后過濾備用。如不急用可不煮沸而在室溫待其成熟，染液可較長期貯存使用。核染色鮮明，染色時間5—10分鐘。用該染液染色后，不需分化，充分水洗藍化后即可，伊紅復(fù)染細胞質(zhì)，使用一段時間后就要換新溶液。

3．Hasnsen甲礬蘇木精的配制

A液：蘇木精      1g

      無水乙醇    10ml

B液：鉀礬        20g

      蒸餾水      200ml

C液：高錳酸鉀    1g

      蒸餾水      16ml

三液分別溶化后，將A液倒入B液，再加入C液3ml，充分攪拌均勻后加熱至沸騰，1分鐘左右，將容器置于冷水中使其迅速冷卻，此液配后即可使用，染后無需堿化，細胞核即為藍色，效果較好，高錳酸鉀可以迅速氧化蘇木精（每1g蘇木精需0.177g高錳酸鉀氧化）。

4．伊紅

0.5~1%水溶液或酒精溶液。

1．水溶性伊紅

伊紅    5~10g

蒸餾水  1000ml

冰醋酸  10滴

先將水溶性伊紅加入蒸餾水中，用玻璃棒攪起泡沫后過濾，再加冰醋酸。

2．醇溶性伊紅

伊紅            5~10g

70%~90%酒精   1000ml

冰醋酸  10滴

（四）其它

2．各級濃度酒精的配制

75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即為75%酒精）

3．鹽酸灑精

多用于多種染色過程中的分色，如蘇木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精內(nèi)加0.5~1ml的濃鹽酸(Hcl)。用鹽酸酒精分色后要經(jīng)自來水充分沖洗組織切片，去除所含的酸再作其他處理。

4．碘酒

取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成

5．生理鹽水

以氯化納0.85~0.90g溶于100m1蒸餾水配成的生理鹽水適用哺乳動物

石蠟切片制備基本步驟 之二

                                      

三、取材，固定

（一）   實驗動物的抓取及固定

1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法

要點：（1）動作要輕緩；（2）不要突然襲擊；（3）如發(fā)現(xiàn)動物的毛發(fā)豎起來時，停一會后再抓；（4）將四肢打開，固定在木板或方形蠟板上。

2．實驗家兔的抓取及固定方法

要點：（1）隨時撫摩其頭部；（2）防止被其腳爪抓傷；（3）根據(jù)實驗要求選擇固定方法。

3．豚鼠的抓取及固定方法

要點：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓緊兩耳間頭頸部的皮膚，用另一只手托起臀部送到動物固定臺上。

（二）   實驗動物的編號、標記、分組和被毛去除方法

1．編號和標記方法

（1）染色法

編號原則：先左后右，從前到后

左前腳為1，左側(cè)腹為2，左后腿為3，頭頂為4，腰背部為5，尾基為6，右前腳為7，右側(cè)腹為8，右后腿為9。超過10可用不同的染色的標記液，一種染色為個位，另一種為十位數(shù)。

（2）掛牌法

（3）耳孔法

一般來說，小型動物適宜用耳孔法和染色法，中型動物適用于掛牌法。

2．實驗動物的隨機分組方法

動物實驗時，常常需要將選擇好的實驗動物，按研究需要分成若干個組，分組時為了避免人為因素的影響，常應(yīng)用隨機數(shù)字表進行*隨機化的分組。

3．實驗動物被毛去除方法

剪毛法

拔毛法

剃毛法

脫毛法：系用化學(xué)脫毛劑將實驗動物被毛脫去，適用于無菌手術(shù)野的準備以及觀察動物皮膚血液循環(huán)和病理變化。方法：將需脫毛部位的被毛先用彎頭剪刀剪去，盡量剪短，勿剪破皮膚。然后用溫水將該部位潤濕，再用紗布包扎棉球的小棒蘸脫毛劑，在需脫毛部位涂一層，經(jīng)2~3min后，用溫水洗去該部位脫下的毛，自然晾干備用，切勿用紗布去擦，以免損傷皮膚。

脫毛劑配方：

（1）硫化鈉3g

     肥皂粉1g

     淀粉7 g

     加水適量調(diào)成糊狀

（2）硫化鈉8g

     溶于100ml水中

（3）硫化鈉8g

     淀粉7 g

     糖4 g

     甘油5 g

     硼砂1 g

     加水75ml

（三）   實驗動物處死

處死動物的方法很多，無論是采用哪種方法，都要盡力避免使動物長時間陷于痛苦和瀕于死亡狀態(tài)。熱愛生命，珍愛動物。

1．空氣栓塞致死法

要點：（1）常用于大的動物（如：兔、貓、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各臟器淤血明顯。

2．麻醉后處死法

注：采用此方法，取材后一定要確定動物是否已死亡，再行斷頸。

（1）吸入麻醉法

要點：（1）適用于較小的動物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）時間大約1~2分鐘；（3）注意防火

（2）注射麻醉法

要點：（1）適用范圍較廣；（2）注射方式可采用靜脈、腹腔、皮下和肌內(nèi)注射，常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般視動物大小而定。

3．腦、脊破壞法

要點：（1）常用于蛙類；（2）用金屬針經(jīng)枕骨大孔進入，破壞大腦和脊髓。

4．斷頭處死法

要點：（1）常用于小動物；（2）用剪刀剪斷頸椎；（3）如果沒有特殊要求，不要使頭和軀干分離。

5．斷椎法

要點：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定頭部，一手拽住實驗動物的尾部，輕輕一拉扯斷其頸椎，使其脫位，椎管內(nèi)急性損傷癱瘓或死亡后取材；（3）此方法處死動物組織結(jié)構(gòu)保存較好。

（四）   實驗動物解剖

解剖步驟

1．實驗動物被麻醉或處死后，將其；固定在動物解剖臺上，用紗布蘸取生理鹽水濕潤被毛；

2．從下頜至恥骨聯(lián)合沿正中線切開皮膚；

3．打開腹腔：沿肋骨下緣腹正中，用鑷子提起腹壁切開腹壁肌肉，至恥骨聯(lián)合，從肋骨下端向脊柱方向，將兩側(cè)腹壁剪開，充分暴露腹腔內(nèi)臟器；

4．打開胸腔：用剪刀沿肋骨的肋軟骨和骨的連接處由下向上剪開，不要剪斷鎖骨，剪時應(yīng)盡量貼著胸內(nèi)壁，并注意不要剪斷胸骨兩側(cè)的大血管。然后將肋弓提起，暴露腹腔內(nèi)臟器。

（五）   取材

取材一定要迅速，應(yīng)在動物處死后立即進行解剖和切取組織材料，否則會引起細胞發(fā)生死后變化，進而失去原有的結(jié)構(gòu)，如果進行酶組化染色，將會使大量的酶失活和丟失。

取材方法和注意事項

（1）取材用的刀剪必須鋒利，取材時應(yīng)用鑷子夾該組織的周圍的結(jié)締組織，凡是用鑷子夾過的或用手壓過的組織均不可用。

（2）根據(jù)實驗要求選擇不同的取材方法（整體取出臟器法、單個臟器取出法和切取組織塊法等）

（3）取材的先后順序原則。根據(jù)死后組織結(jié)構(gòu)改變的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神經(jīng)組織。

（4）取材組織塊的大小既要保證組織的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm為好，但有些特殊要求的可視情況而定。

（5）較小的組織或器官（淋巴結(jié)、松果體、腦垂體和神經(jīng)節(jié)等）應(yīng)整體固定，但要破壞其表面一側(cè)的被膜。

（6）管狀及囊狀組織（消化管的取材）都不應(yīng)斜切，先將一段腸管或食管剪下，從中剪開管腔，使之成片狀，然后將其鋪在紙板下，黏膜面朝上，用大頭針或細線將四邊固定，用生理鹽水漂洗黏膜表面，然后固定。

（7）較細的管狀臟器（輸尿管、輸精管、輸卵管、中動脈和靜脈等）應(yīng)取下1~2cm長，平鋪于硬紙片上或吸水紙上分段固定。

（8）取材要盡量注意臟器的完整性。

（9）應(yīng)根據(jù)所要觀察的部位及實驗?zāi)康倪M行選擇組織的切面。對于病理材料，除切取病變部位外，還要切取病變和正常組織交界部分的區(qū)域，以利于進行正常組織與病理組織的對比觀察分析。

（10）取材時要注明取材時間、組織器官名稱、固定液名稱、組織塊的數(shù)量、所取組織位于器官的部位等，以備查。

（六）   固定

1．固定的目的

2．固定的對象和方法

（1）固定的主要對象是蛋白質(zhì)；

（2）固定液的量要足夠，其固定液的量一般不少于組織總體積的10倍以上（一般為1：20）。對于某些需要制作神經(jīng)染色和酶組織化學(xué)染色的組織固定，比一般的固定要嚴格。

3．固定液的性質(zhì)和條件

（1）能迅速滲入組織，使組織細胞形態(tài)在短期內(nèi)不至于有較大變化。

（2）固定液有相當?shù)臐B透力，對組織各部分的滲透力相等，可使組織內(nèi)外*固定。

（3）使組織細胞不至于因固定而引起人為的改變。

（4）盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮。

（5）使組織達到一定硬度，獲得較佳的折光率和對染料具有較強的親合力。

4．固定時應(yīng)注意的事項

（1）固定液及被固定的組織必須新鮮；

（2）固定液的用量一般為組織體積的10~20倍，容器不要過小，材料也不要太多；應(yīng)避免組織緊貼瓶底或瓶壁，以免影響固定液的滲入，必要的時候可以在瓶底墊上一層棉花；

（3）固定時間視組織塊的種類、性質(zhì)、大小，固定液的種類、性質(zhì)、滲透力的強弱，固定時的溫度的高低，實驗?zāi)康牡龋?/span>

（4）防止被固定的組織因固定劑的作用而發(fā)生變形；

（5）固定所用的固定液，以新配的為好，放置過久會失效；

（6）在固定期間搖動組織或搖動容器有利于固定液的滲入，對長期固定的標本，可經(jīng)常更換固定液

（7）取材固定應(yīng)同時作好記錄，包括組織名稱、固定液和時間等內(nèi)容。

5．固定劑

單純固定劑

（1）10%甲醛：對組織滲透性強，固定均勻。對組織膨脹約5%，經(jīng)酒精脫水時有較大的收縮。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，長期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝裕焕谌旧?，特別是細胞核的著色。經(jīng)自來水沖洗6~24小時后，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶。

（2）4%多聚甲醛：對組織穿透性好，組織收縮小，對大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，特別是對脂肪和各種酶的固定效果更好。固定的時間不宜太長，以24小時以內(nèi)為宜，適用于免疫組織化學(xué)染色。

（3）冰醋酸：滲透力強，沉淀核蛋白，對染色質(zhì)固定好，使組織膨脹，故一般不單獨使用。

（4）鋨酸：價格昂貴，為強氧化劑，易還原成氫氧化鋨，呈黑色沉淀；必須避光保存。不能沉淀蛋白質(zhì)，而使蛋白質(zhì)凝膠化，所以對蛋白質(zhì)固定不均勻，鋨酸固定的細胞能保持生活時的形態(tài)，不收縮細胞，對胞質(zhì)固定較長好，核的固定不好，鋨酸為脂肪及類脂質(zhì)的優(yōu)良固定劑，經(jīng)它固定的脂肪和類脂質(zhì)呈黑色，特別是對于是顯示線粒體和高難度爾基復(fù)合體效果良好。

混合固定劑

（1）Carnoy液：滲透力強，特別適宜于固定染色體、肝糖、粘液等一些較為細微的結(jié)構(gòu)。顯示DNA、RNA效果良好。

（2）改良Bouin氏固定液：此液對一般組織固定效果都很好，固定時間為4~18小時，固定后直接放70%乙醇脫水，固定時間較長對組織亦無損害。

（七）   組織塊修整

固定后的組織塊可能會在外部形態(tài)上有些改變，或者由于組織在還未固定時就取材，組織器官較軟，取材不容易切平。經(jīng)固定后的組織有一定的硬度，此時就可以做一些修整，但改變不要太大，只是將組織材料切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位。修整組織塊時，手術(shù)切片一定要鋒利。

                                      

四、水洗

1．目的：

洗去滲入組織中的固定液，終止固定。以免影響對組織內(nèi)結(jié)構(gòu)的觀察、分析和研究。

2．原則和方法：

固定后的組織塊的沖洗，一般情況下是置水下以自來水流水沖洗，這樣可以使組織中的固定液隨時溢出，洗得更干凈*，有些還需要進行特殊的洗滌。

 

五、脫水包埋

（一）脫水

1．脫水的目的

組織內(nèi)的水不能和支持劑混合，所以必須把組織中的水分*脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟，有利于組織的保存。

2．脫水劑

（1）乙醇：可作固定劑，又可脫水劑，但乙醇與水混合時有較劇烈的物理反應(yīng)。高濃度的酒精對組織有強烈收縮及脆化的缺點，因此用乙醇脫水不能直接入純酒精中脫水，而必須經(jīng)過由高到低的一系列不同濃度的酒精，逐漸取代組織中水分，以保證組織脫水*，并避免組織過度收縮和硬化。

（2）丙酮：脫水能力比酒精強，但對組織的收縮更大，在組織學(xué)制片中較少使用，多用于病理快速切片，或用于某些組化水解酶的固定。

（3）正丁醇：是較好的脫水兼透明劑，可與酒精及石蠟混合，用于脫水是可先經(jīng)過各種不同濃度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，進行石蠟包埋時，可先用正丁醇和石蠟等量混合液，然后浸入純石蠟包埋，正丁醇用于脫水的優(yōu)點是很少引起組織收縮和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脫水劑，但由于價格較貴，不常使用。

3．步驟

（1）乙醇脫水過程

50%乙醇      6~8小時

75%乙醇      6~8小時

85%乙醇      3~5小時

95%乙醇      1~2小時

95%乙醇      1~2小時

100%乙醇Ⅰ   1小時

100%乙醇Ⅱ   1小時

（2）丙酮脫水

如果是丙酮固定的組織，則不必再經(jīng)過乙醇，可以用新丙酮更換一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的組織，均按上述乙醇脫水方法脫水，亦可由100%乙醇中移入丙酮繼續(xù)脫水2~4小時再入二甲苯透明，透明后浸蠟包埋。

（3）正丁醇脫水

組織用正丁醇脫水前，先經(jīng)50%乙醇脫水，然后移入正丁醇和乙醇混合液進行脫水。

50%乙醇                              6~12小時

50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸餾水        5~8小時

50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸餾水        4~6小時

45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸餾水        3~5小時

25%乙醇+75%正丁醇                   2~3小時

25%乙醇+75%正丁醇                   1~2小時

15%乙醇+85%正丁醇                   1~2小時

5%乙醇+95%正丁醇                    1~2小時   

100%正丁醇Ⅰ                         1小時

100%正丁醇Ⅱ                         1小時

4．注意事項：

（1）脫水的過程應(yīng)逐步地而不應(yīng)驟然地進行，不能操之過急。

（2）脫水的時間應(yīng)根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。

（3）組織塊在高濃度，特別是無水乙醇內(nèi)不能放置的時間太長。無水乙醇吸水能力太強，容易造成組織塊的過度硬化，使得切片理組織易碎裂。

（4）在脫水的過程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。

（5）每次更換新的脫水劑時（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，裝組織塊的容器也要控干水分，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。

（6）脫水劑的先擇要根據(jù)實驗的要求及實驗室的條件

（二）透明

1．透明的目的

置換組織內(nèi)的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用；

使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光線的透過。

2．透明劑

（1）二甲苯：是現(xiàn)在應(yīng)用廣的一種透明劑，價格較便宜，不能和水混合，遇水則變成乳白色渾濁，因此必*脫水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蠟，透明力強；其大的缺點是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不能在其停留過久，透明時間視組織塊的大小、性質(zhì)而定；有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因組織過硬不易切片；長時間接觸，對粘膜有刺激作用。

（2）苯：性質(zhì)與二甲苯相似，對組織收縮也較小，組織也不易變脆，但透明較慢，組織在其內(nèi)可以滯留12~24小時，但毒性較大。

（3）香柏油：用為透明劑，效果很好，有高度透明作用，能與醇和二甲苯混合，香柏油對組織的硬化及收縮程度比任何其他透明劑都要小，但透明的速度較慢，3mm以下厚度的組織塊需12小時以上。香柏油與石蠟不易融合，即香柏油不易被石蠟取代，因此經(jīng)香柏油透明以后，可經(jīng)過二甲苯短時間媒浸，再進行石蠟包埋。肌肉、皮膚、血管、膀胱、垂體及腎上腺等用香柏油效果較好。

3．二甲苯的步驟：兩次透明

4．注意事項

（1）時間不宜過長，否則組織會變脆；

（2）組織塊脫水必*。

（三）浸蠟、包埋（石蠟包埋法）

1．浸蠟

（1）浸蠟的目的

置換組織中的透明劑，為包埋做準備。

（2）浸蠟的步驟

在60度恒溫蠟箱中放置3個蠟杯，分別編號1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分別盛軟蠟、軟蠟、硬蠟，取透明好的組織塊放入軟蠟中各1小時，迅速取出放入硬蠟，同樣放置1小時。如果時間來及包埋，可以將已經(jīng)完成浸蠟的組織塊取出放在溫箱外，第二天繼續(xù)。

（3）注意事項

溫箱中的溫度必須嚴格控制在60℃的范圍，不能超過60℃；浸蠟時間不宜過長。浸蠟溫度過高或時間過長使組織收縮過度收縮和脆變。

2．包埋

（1）步驟

①準備包埋蠟：一般應(yīng)用硬蠟（56~58℃或60~62℃）為好，所用的石蠟要求透明無雜質(zhì)，新的石蠟要反復(fù)熔凝，并有一定的粘韌性，可以加一些蜂蠟。蠟的熔點應(yīng)與組織的硬度相適應(yīng)。包埋用過的石蠟可以反復(fù)使用。

②準備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。

③點燃酒精燈，準備好無齒尖鑷子，需作標記應(yīng)先寫好標簽。

④在金屬框中倒入硬蠟，然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向?？墒覝叵吕鋮s。

⑤包埋框或紙盒內(nèi)的蠟逐漸凝結(jié)，若表面已凝結(jié)形成一層固體狀，即可放入冷水中，加速其凝固。

⑥待蠟塊*凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆開紙盒，取出蠟塊。

（2）注意事項

①包埋時夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時燒熱，以免石蠟?zāi)Y(jié)后粘附在鑷子上，造成蠟塊凝固不均勻。

②包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時間應(yīng)盡量縮短。

③包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組織的底部，應(yīng)考慮這樣幾個方面的問題：a. 脫水不*。b.包埋蠟溫度低了，組織進行包埋時，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。c.組織內(nèi)還殘留有較多的透明劑，d.石蠟不純。

④包埋箱中的溫度必須保持恒定。

⑤如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。

⑥較小的組織可在脫水透明時開始用伊紅染色

 

六、石蠟切片制備

（一）石蠟切片前的準備

1．切片刀。傳統(tǒng)的切片刀在使用之前，一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度，然后進行磨刀?，F(xiàn)在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。

2．修整蠟塊：切去組織周圍過多的石蠟，一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊，兩邊必須平行。

3．蠟塊固定：修整好的蠟塊先固定在事先準備好的小方木塊或者金屬塊上，固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱，再將蠟塊底部烙熔，迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。

4．載玻片擦洗干凈后，在其表面涂上粘附劑（蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸），根據(jù)染色方法選擇不同的粘附劑。

5．準備好毛筆、鑷子、染色架。

6．調(diào)好展片器內(nèi)水的溫度（45℃），有時也可以加些酒精到水中。

（二）石蠟切片

1．將切片刀裝在刀片機的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。

2．切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機，切片時，左手執(zhí)毛筆，右手轉(zhuǎn)切片機轉(zhuǎn)輪，先修出組織塊。

3．調(diào)整切片機上的切片厚度為4~7µm，然后切片。

4．切片可以是單張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶

5．展片和撈片：

（1）直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待*展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時擺正切片。

（2）溫水漂浮法：此法用展片機或者用恒溫水浴箱，先使水溫保持在45~50℃，用左手拿毛筆輕輕托起切片，用右手用眼科鑷子夾起切片的一角，正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上，動作要輕快，切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會自然平整地展開，必要時可用眼科鑷輕輕拔開，然后撈片，并及時編號。

6．展好的切片在室溫下稍微干燥后，放在40℃恒溫烤箱中，小片組織30分鐘即可，大的需12~24小時，烤干備用。

（三）注意事項

1．切片刀刃傾斜過大或過小都不能正常進行切片。

2．修整蠟塊時要細心，看清楚組織在蠟塊中的位置，以免將需要的組織修掉。

3．連續(xù)轉(zhuǎn)動切片機的轉(zhuǎn)輪時，速度一定要均勻，不能時快時慢，以免切片厚薄不一。

4．使用輪轉(zhuǎn)式切片機切片時，是由下向上切，為得到定然整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬、脆難切的部分放在上端，如皮膚應(yīng)將表皮部分向上，腸胃等組織應(yīng)將漿膜面面朝上。

5．用展片器展片時，水溫應(yīng)根據(jù)使用的石蠟熔點進行了調(diào)整，一般低于石蠟熔點10~15℃；撈片的時候動作要輕、稍快。動作太大容易出現(xiàn)氣泡。如果沒有展片器可以用溫水浴鍋來代替。

6．單個切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處；連續(xù)切片的粘片順序一般是從左到右，組織切片較小是，可以并列粘貼2~3條蠟帶。

7．烤片的溫度不宜過高；烤片的時間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后，才能烤片，否則容易產(chǎn)生氣泡影響染色和觀察。

 

七、H-E染色

（一）步驟

1．脫蠟

二甲苯I             10分鐘

二甲苯II             5分鐘

2．水化

100%酒精I            5分鐘

100%酒精II           5分鐘

95%酒精I             5分鐘

95%酒精II            5分鐘

85%酒精              3分鐘

75%酒精              2分鐘

蒸餾水沖洗           1分鐘

3．染色

蘇木精染色           5分鐘

自來水洗

鹽酸酒精分化         15秒

自來水洗（鏡檢）

自來水洗             15分鐘

蒸餾水洗              2分鐘

75%酒精              2分鐘

85%酒精              2分鐘

0.5%伊紅染色         1分鐘

95%酒精I             5分鐘

95%酒精II            5分鐘

100%酒精I            5分鐘

100%酒精II           5分鐘

二甲苯I               5分鐘

二甲苯II              5分鐘

4．封片

中性樹膠封片

上述處理好的玻片，取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發(fā)生氣泡

（二）注意事項

1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的處理是不一樣的。

2．染色過程中所用的時間要根據(jù)染色時的室內(nèi)溫度、染液的新鮮程度及實驗室的實際情況等靈活掌握。在室溫高、切片、染色液又是新配制的，染色時間就要短，反之時間就長。

3．伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應(yīng)該在脫水前進行染色，如果是醇溶的，應(yīng)使用與溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。

4．在二甲苯脫蠟之前可以先在60℃烤箱內(nèi)0.5~1小時，這樣可以使切片粘附更牢固不易脫片，也有利于脫蠟。

5．二甲苯在HE染色中有脫蠟、透明的作用。二甲苯脫蠟的好壞主要取決于切片在二甲苯內(nèi)放置的時間和脫蠟時的溫度以及二甲苯的使用次數(shù)。染好的切片必須經(jīng)過透明，有利于顯微鏡觀察，同時并為封片起到了橋梁作用。

6．用梯度酒精脫水時，在低濃度酒精中時間不宜過長，到高濃度時逐步延長脫水時間。以免脫水不*，影響二甲苯透明的效果。

7．在酸性分化液內(nèi)停留的時間不要過長，分化不可過度，避免使細胞核內(nèi)該染上色的結(jié)構(gòu)脫色。不需分化處理的蘇木精染色時要注意掌握染色時間，以防止組織切片染色背景過深或細胞核、胞質(zhì)染色不足。