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細(xì)胞周期檢測(cè)染料:
可用于細(xì)胞周期檢測(cè)的熒光染料有碘化丙啶(Propidium,簡(jiǎn)稱PI)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,簡(jiǎn)稱DAPI)、Hochest、7氨基放線菌素(7-Amino-ActinomycinD,簡(jiǎn)稱7AAD)等。
細(xì)胞周期PI法原理:
PI法是較常見的一種周期檢測(cè)方法。PI是一種雙鏈DNA的熒光染料,與雙鏈DNA結(jié)合后可產(chǎn)生熒光,并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被PI染色后,可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定,然后根據(jù)DNA含量的分布情況,可進(jìn)行細(xì)胞周期分析。PI染色后,假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1,那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2,正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2之間。
細(xì)胞周期檢測(cè)步驟:
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:
收集細(xì)胞,用1ml預(yù)冷PBS洗1遍,輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞,避免細(xì)胞成團(tuán)。
2. 細(xì)胞固定:
加入1ml預(yù)冷的70%乙醇中,輕輕吹打混勻,4度固定2小時(shí)或更長時(shí)間(固定12-24小時(shí)可能效果更佳)。1000g離心3-5分鐘,沉淀細(xì)胞(如果細(xì)胞沉淀不充分,可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或加大離心力)。棄上清,用用1ml預(yù)冷PBS洗1遍。
3. PI染色:
每個(gè)樣品用0.5ml染色緩沖液(或PBS)重懸,加入25ul PI染色液(20×)、10ul RNase A(50×)。37度避光溫浴30分鐘。
4. 流式檢測(cè):
用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測(cè)紅色熒光,同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。
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