United States Biological

上海乾思生物United States Biological品牌代理經(jīng)營進(jìn)口胎牛血清、細(xì)胞因子、ELISA試劑盒、細(xì)胞、抗體、生物試劑、耗材、培養(yǎng)基、一抗、二抗、其產(chǎn)品吸附均勻，吸附性好，空白值低，孔底透明度高，代做ELISA實驗等。完善的庫存及供應(yīng)體系以及高效穩(wěn)定的純化技術(shù)，保證產(chǎn)品均能現(xiàn)貨供應(yīng)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

測序?qū)嶒灹鞒蹋?br style="box-sizing: border-box; margin: 0px;"/>1 收集樣品
2 相關(guān)試劑 總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶), RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix (熒光定量PCR預(yù)混試劑)。
3 實驗儀器 熒光定量PCR儀; PCR儀;低溫離心機(jī)。
4 總RNA提取
5 cDNA合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl); 2µl隨機(jī)引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl體系。混勻后70℃變性RNA 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl體系。PCR儀中反應(yīng)條件設(shè)置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應(yīng)。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?br style="box-sizing: border-box; margin: 0px;"/>6 引物設(shè)計與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7 實時定量PCR 按以下反應(yīng)體系進(jìn)行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR儀擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個循環(huán))。
8 PCR產(chǎn)物溶解曲線分析 將所擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。溶解曲線生成的反應(yīng)程序為: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。