PCR實(shí)驗(yàn)室入門級別的知識要點(diǎn)

一、PCR實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)原則
原則上應(yīng)當(dāng)設(shè)置4個(gè)區(qū)域：試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。
根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。
使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；
采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的自動化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。
各區(qū)功能準(zhǔn)備物品清單：
1、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)（1區(qū)）
功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。
準(zhǔn)備物品：
（1）2～8℃和-20℃以下冰箱
（2）混勻器
（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
2、標(biāo)本制備區(qū)（2區(qū)）
功能：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。
準(zhǔn)備物品：
（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱
（2）高速離心機(jī)
（3）混勻器
（4）水浴箱或加熱模塊
（5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
（6）生物安全柜。
3、擴(kuò)增區(qū)（3區(qū)）
功能：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測。
準(zhǔn)備物品：核酸擴(kuò)增儀（或熒光定量PCR儀）
4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)（4區(qū)）
功能：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
準(zhǔn)備物品：
（1）雜交儀、電泳儀、測序儀等
（2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
通用物品：（4個(gè)區(qū)都有可能需要）
（1）可移動紫外燈（近工作臺面）
（2）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭
（3）專用工作服和工作鞋(套)
（4）專用辦公用品
（5）樣本管架（2區(qū)）
（6）防爆夾（2區(qū)）
（7）PCR管架（2區(qū)、傳遞窗）
二、PCR實(shí)驗(yàn)室工作基本原則
1、進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行
試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→ 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。
2、各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。
3、不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。
4、實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。
5、工作結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺表面應(yīng)當(dāng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺上60～90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對（bp），對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長照射時(shí)間，最好是照射過夜。
6、實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。
三、注意事項(xiàng)
1、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)
貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測區(qū)，試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在該區(qū)，應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。
2、標(biāo)本制備區(qū)
由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。
3、擴(kuò)增區(qū)
為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)當(dāng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。
4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標(biāo)記或非放射性核素標(biāo)記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)當(dāng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。