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動(dòng)物細(xì)胞染色體DNA之制備詳細(xì)的方法步驟！
閱讀：2203 發(fā)布時(shí)間：2012-10-18
動(dòng)物細(xì)胞染色體DNA之制備
I.目的
動(dòng)物、植物及微生物等的基因圖譜（gene mapping）的構(gòu)筑，以及基因順序（gene sequencing）的建立與分析比較，是目前分子生物研發(fā)的重要課題。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)乃針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)之后，抽取染色體DNA為*步，后續(xù)的DNA定序、基因分析、圖譜建立、DNA鑑定等于淵展開。
以目前的估計(jì)，人類約有10萬個(gè)基因，30億個(gè)堿基。預(yù)定在2005年將人類基因*解析出來，并確定它們?cè)谌旧w上的位置。根據(jù)1990年當(dāng)時(shí)的物價(jià)，每解析出一個(gè)堿基的平均成本約為美金1元，故HGP總共需約30億美金來完成。
一旦人類基因輿圖*解析出來之后，科學(xué)家就可以尋找每段基因的功能，利用這些資料進(jìn)一步找出疾?。ㄈ鏰i癥或心臟?。┡c基因的關(guān)系，另外亦提供開發(fā)新藥或?qū)ふ倚轮委煼椒ǖ念I(lǐng)域，如同在美國(guó)NASDAQ上的網(wǎng)路股一樣，充滿了無限的想像空間。在巨大商業(yè)利益的引誘之下，許多私人制藥公司已經(jīng)開始投入HGP的研究工作，期能將重要的基因找出來
II.染色體DNA的制備
1.儀器用具：
a. 無菌操作臺(tái)
b. 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱
c. 倒立顯微鏡
d. 50 ℃恒溫箱具搖盪器
e. 冷凍離心機(jī)
2.藥品及試劑：
a. 同實(shí)驗(yàn)20
b. Digestion buffer （100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% SDS, fresh 0.1 mg/ml proteinase K）
c. phenol/chloroform
3.方法步驟：
１）培養(yǎng)HeLa細(xì)胞在100 mm培養(yǎng)皿中3~4天，讓細(xì)胞佔(zhàn)滿生長(zhǎng)平面空間（confluence < 3 ´ 107 cells ），加入10 ml PBS緩衝液清洗細(xì)胞表面，再將PBS儘量*吸掉。
２）加入1 ml Trypsin-EDTA（以能覆蓋細(xì)胞表面為原則），置入37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱數(shù)分鐘，單層細(xì)胞全脫落。
３）加入3 ml培養(yǎng)液沖洗下細(xì)胞，在4 °C下以4,000 rpm離心1分鐘。
４）吸掉上層液，加入5 ml PBS懸浮細(xì)胞，在4 °C下以4,000 rpm離心1分鐘。
５）吸掉上層液，加入30 ml digestion buffer懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml微量離心管中，置于搖盪器上放入50 °C恒溫箱中過夜*。
６）取出微量離心管，小心加入300 ml phenol 萃?。▍⒄諏?shí)驗(yàn)2）。
７）離心后轉(zhuǎn)移上清液至新的微量離心管，加水成總體積為500 ml，加入phenol/chloroform做萃?。▍⒄諏?shí)驗(yàn)2）。
８）離心后，做酒精沈淀DNA（參照實(shí)驗(yàn)2）。
９）將染色體DNA懸浮于300 ml TE溶液中，取少量作DNA定量分析（參照實(shí)驗(yàn)2）。
10）取染色體DNA用EcoRI做限制酶切割，并做DNA電泳分析（參照實(shí)驗(yàn)3）。
*注：1.在步驟5之后，若DNA黏滯性太高，無法做萃取時(shí)，建議在過夜反應(yīng)后，以1ml針筒劇烈抽放染色體DNA，以抽放重覆動(dòng)作，可把DNA作物理性截?cái)啵╯hearing），或利用超音波破膜機(jī)來截?cái)郉NA。
2.染色體DNA若有截?cái)嗵幚恚讲襟E10即可省略限制酶EcoRI的切割，直接作電泳分析。
參考資料:
顯微鏡百科
http://www.jiance17.com