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SEC分析中樣品吸附的改善:色譜柱的預處理

時間:2025-4-1 閱讀:291
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SEC分析中樣品吸附的改善色譜柱的預處理

 

Wyeth BioPharma公司在一項方法優(yōu)化與研究中發(fā)現(xiàn),在對從細胞培養(yǎng)原料中經多步正交純化得到的表觀分子量為140 kDa的蛋白質的各組分進行SEC分析時,使用BSA(牛血清白蛋白)對色譜柱進行預處理,顯著提高了重現(xiàn)性和回收率。

 

Wyeth BioPharma在三步細胞培養(yǎng)純化的每個階段都會采用SEC分析,以確定目標蛋白中高分子量物質的純度和回收率。細胞培養(yǎng)物通過蛋白A親和層析以及后續(xù)的精制步驟進行純化。在蛋白A洗脫后片段的SEC分析中,高分子量物質區(qū)域的洗脫峰回收率和重現(xiàn)性差異很大,這表明樣品可能吸附在填料上。為了減少這種差異,實施了用BSA進行預處理的實驗方案。

 

分析條件

色譜柱:        TSKgel G3000SWXL7.8 mmI.D.×30 cm, 5 μm

流動相:        磷酸鹽緩沖液pH 6.5

樣    品:        進樣量50 μL,進液50 μg

檢    測        UV@280 nm

進樣量:        10 µL

 

討論

 

1所示,蛋白A純化樣品在高分子量區(qū)域的回收率(%HMW僅為1.1%。在向色譜柱中注入10份、每份20 μL、濃度為5 mg/mLBSA后,回收率提高到了3.5%。在未進行BSA處理的情況下,從以往的數(shù)據(jù)來看,使用新色譜柱時的蛋白A純化樣品的%HMW值為1.0%1.4%,而在進樣多達60次后,該值會逐漸上升至3.5%4.0%。有趣的是,這一結果僅在蛋白A純化樣品中表現(xiàn)明顯。

 

img1 

1  BSA處理前后的蛋白A樣品的疊加圖

 

1  BSA處理前后的全部三種樣品的回收率

樣品

處理前 % HMW

處理后 % HMW

蛋白A純化之后

1.1

3.4

精制層析步驟1之后

1.5

1.5

精制層析步驟2之后(最終產品)

0.2

0.2

 


1所示,BSA預處理對從下游層析步驟中獲得的樣品沒有影響。進一步的表征分析表明,與精制后的樣品相比,蛋白A純化樣品中存在較高水平的宿主細胞蛋白(HCP)。研究發(fā)現(xiàn),這些HCPSEC分析圖譜的HMW區(qū)域被洗脫出來。此外,當對BSA處理后的蛋白A純化樣品進行SEC分析時,發(fā)現(xiàn)與BSA處理前對同一樣品進行SEC分析時的結果相比,經BSA處理后的樣品在HMW區(qū)域中的宿主細胞蛋白含量更高。這表明,樣品與色譜柱填料之間的相互作用在HCP上表現(xiàn)得最為普遍,而非目標分子的HMW物質。

 

研究結論

BSASEC柱進行預處理可以減少二次相互作用并提高分析間結果的一致性。在這個特定的實驗方案中,與下游純化步驟(精制步驟1和步驟2)中HMW回收率未受影響的情況形成對比的是,蛋白A純化組分在結果一致性方面有了顯著改善,這為進一步表征蛋白A純化樣品中的高分子量組分提供了契機。這一表征工作得出的結論是,對從早期純化步驟所得樣品進行SEC分析的結果,可能會受到源自細胞培養(yǎng)環(huán)境的非產品相關雜質的不利影響。

 

參考文獻

1.       Y. Kato et al; J. of Chromatrogr.404 (1987) 333-339

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