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士鋒生物ELISPOT入門知識
最近更新時間：2013-7-26
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詳細(xì)介紹：
一、 elispot.html' target='_blank'>ELISPOT技術(shù)概述
1、技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)
ELISPOT全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來（Sedgwick JD 2005）。
該技術(shù)檢測細(xì)胞因子具有三大優(yōu)點(diǎn)：其一，靈敏度高。在一百萬個陰性細(xì)胞中只要有一個分泌細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞即可被檢測出來。這是目前為止，zui為靈敏的檢測技術(shù)，靈敏度比傳統(tǒng)的的ELISA方法高2-3個數(shù)量級。其二，單細(xì)胞水平，活細(xì)胞功能檢測。ELISPOT檢測的是單個細(xì)胞分泌，而非細(xì)胞群體的平均分泌。在檢測的過程中，有活細(xì)胞培養(yǎng)與抗原刺激階段，檢測的是活細(xì)胞的功能，而非死細(xì)胞的物。其三，操作簡便經(jīng)濟(jì)，可以進(jìn)行高筒量篩選。ELISPOT沒有復(fù)雜的細(xì)胞體外擴(kuò)增過程，不使用同位素，不需要大型的、專門的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。按照標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作，一個實(shí)驗(yàn)者可以同時處理數(shù)百個樣品，效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它檢測方法（Kalyuzhny AE 2005）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計在96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行，直接以培養(yǎng)板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纖維素膜為基質(zhì)，包被上特異性的單克隆抗體，用以捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。（由于涉及到細(xì)胞培養(yǎng)的過程，對單克隆抗體的要求要遠(yuǎn)高于ELISA中的捕獲抗體，該抗體需要無毒，不含內(nèi)毒素，親和力高等特點(diǎn)。）之后，在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)基（現(xiàn)在無血清ELISPOT技術(shù)已經(jīng)成熟，培養(yǎng)基中可以不再含有血清）、待檢測的細(xì)胞以及抗原刺激物進(jìn)行培養(yǎng)。
在特異性的抗原或者非特異性的有絲分裂原的刺激下，數(shù)小時之內(nèi)，T細(xì)胞就會開始分泌各種細(xì)胞因子。細(xì)胞因子當(dāng)即就被位于細(xì)胞下方的膜上的單克隆抗體所捕獲。在洗去細(xì)胞之后，被捕獲的細(xì)胞因子可以與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，然后用酶標(biāo)親和素再與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色，就可以在膜的局部形成一個個圓形的斑點(diǎn)。每一個斑點(diǎn)就對應(yīng)了當(dāng)初一個分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，這些細(xì)胞被稱為斑點(diǎn)形成細(xì)胞（Spots forming cells SFCs）。統(tǒng)計膜上的斑點(diǎn)的數(shù)目，再除以當(dāng)初加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，就可以計算出陽性細(xì)胞的頻率。
2、ELISPOT的發(fā)展歷史
ELISPOT方法從創(chuàng)立至今已經(jīng)有20多年的歷史了。1983年，在地球南北兩個半球地理位置相距遙遠(yuǎn)的兩個研究小組幾乎同時、獨(dú)立的創(chuàng)立了這項(xiàng)技術(shù)。一個研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人是當(dāng)時正在當(dāng)?shù)?/span>Margaret女王醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)研究所攻讀博士學(xué)位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。另一個研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物系的學(xué)者Cecil C. Czerkinsky （Czerkinsky CC et. al., 1983a）。前者開創(chuàng)ELISPOT方法是為了研究B淋巴細(xì)胞分泌IgM抗體的情況（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴細(xì)胞分泌抗體的情況（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），還應(yīng)用于大腸桿菌分泌腸毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纖維細(xì)胞分泌纖維連接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究中。雖然研究的對象不一樣，但是該實(shí)驗(yàn)技術(shù)所涉及的原理以及方法步驟和我們現(xiàn)在的標(biāo)準(zhǔn)ELISPOT幾乎*相同。
這二十多年來，ELISPOT基本技術(shù)并沒有什么重大變化，但是技術(shù)進(jìn)步一直沒有停頓，實(shí)驗(yàn)材料的改進(jìn)了，實(shí)驗(yàn)靈敏度與重復(fù)性提高了，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域也拓寬了。
（1）底板材質(zhì)的改進(jìn)
ELISPOT技術(shù)從創(chuàng)立之初，檢測底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此實(shí)驗(yàn)的靈敏度有限。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 將膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），檢測的也是分泌抗體的陽性B細(xì)胞。他們引入的是硝酸纖維素膜，獲得了遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于塑料板的結(jié)果。1995年，荷蘭Utrecht大學(xué)免疫研究所的Schielen P團(tuán)隊(duì)（該團(tuán)隊(duì)后來掛靠Utrecht大學(xué)，創(chuàng)辦了荷蘭U-Cytech公司，成為世界上*的ELISPOT試劑盒生產(chǎn)商之一）把一種更優(yōu)于硝酸纖維素膜的PVDF膜也被引入了ELISPOT檢測中（Schielen P et. al., 1995）。做過Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纖維素膜有更優(yōu)的蛋白吸附性質(zhì)，更加精細(xì)的顯色條帶分辨率。因此，PVDF的引入是繼硝酸纖維素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破（McCutcheon M et. al., 1997）。至今，PVDF膜幾乎*取代了NC膜（Weiss AJ 2005）。
“反者道之動”。塑料板在被膜板取代之后，沉寂了許多年，現(xiàn)在又開始興旺起來了（Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997）。zui的塑料ELISPOT板當(dāng)數(shù)荷蘭U-Cytech公司研發(fā)的透明板，已經(jīng)成為了該公司的一大特色。塑料ELISPOT板的重新興旺有兩個方面的原因：一方面是技術(shù)進(jìn)步，在塑料材質(zhì)的改進(jìn)之后，板底吸附蛋白的能力已經(jīng)比傳統(tǒng)的塑料板有了很大提高，雖然還趕不上膜板，但是應(yīng)付ELISPOT實(shí)驗(yàn)已經(jīng)綽綽有余。更高質(zhì)量的抗體也有利于塑料板獲得更好的ELISPOT結(jié)果。另一方面歸因于塑料板自身的優(yōu)勢，相對低廉的價格，簡化的操作步驟，簡短的實(shí)驗(yàn)時間都是塑料板的優(yōu)勢（Ronnelid J et. al., 1997）。此外對于透明板，還可以在實(shí)驗(yàn)中隨時觀察細(xì)胞的狀態(tài)與密度，這對新手是很重要的。
（2） 檢測內(nèi)容的多樣化
在ELISPOT技術(shù)創(chuàng)立之初，主要用于檢測B淋巴細(xì)胞分泌的抗體，包括各種類型的免疫球蛋白，包被的材料是特異性的抗原或者抗體的抗體（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）。B細(xì)胞分泌的抗體一般的量比較大，容易檢測，即使早期ELISPOT檢測的靈敏度不夠高，檢測大量分泌的抗體還是不成問題的（Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a）。時至今日，ELISPOT檢測還廣泛地用來研究粘膜免疫中的抗體分泌情況（Holmgren J et. al., 2005）。后來隨著技術(shù)的進(jìn)步，ELISPOT檢測的靈敏度有了大幅度的提高，以至于可以檢測到痕量的細(xì)胞因子，于是它的主要應(yīng)用就轉(zhuǎn)移到檢測細(xì)胞因子上來了（Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989）?，F(xiàn)在各種常見細(xì)胞因子的檢測都有了商業(yè)化的試劑盒，使用起來非常方面。能商業(yè)化檢測的細(xì)胞因子包括人類、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干擾素（γ-IFN）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、顆粒酶（Granzyme B）、腫瘤壞死因子（TNF-α）。目前ELISPOT試劑盒的主要供應(yīng)商有：荷蘭U-CyTech公司、瑞典Mebtech公司、法國Diaclone公司、美國BD Pharmingen公司和R&D公司。他們的產(chǎn)品各有特點(diǎn)，其中荷蘭U-CyTech公司的產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)價廉，在國內(nèi)市場居于主導(dǎo)地位。
（3） 多細(xì)胞因子的檢測
通常的ELISPOT檢測每個孔只檢測一種細(xì)胞因子。如果要在一個ELISPOT孔內(nèi)同時檢測兩種或者兩種以上的細(xì)胞因子，可以包被兩種抗體以捕獲兩種細(xì)胞因子，然后用兩種不同的酶聯(lián)抗體以及顯色劑顯出兩種斑點(diǎn)來。早在1988年，Cecil C. Czerkinsky就提出并且實(shí)現(xiàn)了這種想法（Czerkinsky C et.al,. 1988b）。但是，雙色ELISPOT有一個與生俱來的弱點(diǎn)，那就是斑點(diǎn)分離的問題。大家知道，斑點(diǎn)的混合色屬于物理學(xué)上“顏料的三原色”問題，兩種不同顏色的顏料如果以不同的比例混合，會出現(xiàn)一系列不同的表觀顏色。其中的細(xì)微差異，人的肉眼有時候都難于判斷，何況是自動的讀板儀。所以，在雙色ELISPOT斑點(diǎn)識別上，總會有些混色的斑點(diǎn)無法正確的識別與分類。為了解決這個難題，人們想到了用熒光元及檢測ELISPOT的方法（Ruedl C et. al., 1994; Sarawar SR et. al., 1994）。不同顏色的熒光混合在一起，只要加一張濾光片，就可以的濾出目標(biāo)熒光，而遮蔽掉其它顏色的熒光，熒光之間可以互不干擾。這對于雙因子，甚至多因子ELISPOT檢測都是十分理想的手段（Gazagne A et. al., 2005）。但是熒光ELISPOT檢測目前還有不足之處。由于熒光素直接偶聯(lián)在抗體或者親和素上，缺乏酶催化底物的那種放大作用，所以靈敏度還無法和化學(xué)顯色的ELISPOT方法比較（Gazagne A et. al., 2005）。此外，硝酸纖維素膜自身在激發(fā)下就會發(fā)熒光，所以不適合做熒光ELISPOT底板材料。PVDF膜也有自身發(fā)熒光的問題，雖然不像硝酸纖維素膜那樣嚴(yán)重，但是也會造成背景升高，信噪比下降的問題（Gazagne A et. al., 2005）。荷蘭U-Cytech公司已經(jīng)發(fā)開出了新一代的熒光底板介質(zhì)Hydrogel™，它既有很高的抗體吸附性質(zhì)，又沒有熒光背景。Hydrogel™目前存在的*問題是保存起來不夠穩(wěn)定，限制了它的推廣。綜上所述，多細(xì)胞因子檢測是ELISPOT未來的一個發(fā)展方向，但在技術(shù)上還不夠成熟，有待于改進(jìn)。
二、 ELISPOT的方法
由于有商品化的試劑盒，ELISPOT操作本身已經(jīng)大大簡化。目前的ELISPOT試劑盒按抗體的包被情況分為已包被板的和未包被板的兩類。前者實(shí)驗(yàn)操作簡單，但是背景較高，且價格較貴，所以應(yīng)用不如后者廣泛。按照ELISPOT底板材料分，可以分為PVDF膜板和非PVDF膜板。PVDF板由于疏水性的問題，需要用乙醇預(yù)先潤濕，在洗滌過程中也更復(fù)雜一些。各個公司的試劑盒使用起來大同小異，我們以荷蘭U-Cytech公司的PVDF板IFN-γ 試劑盒威力，列出其操作方法。
1、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作
（1） 設(shè)備與耗材：
超凈工作臺;
5% CO2 37°C 細(xì)胞培養(yǎng)箱;
P20， P200， P1000 微量移液器;
P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器;
Biosys ELISPOT Reader
P20， P200， P1000 槍頭;
多道移液器吸槽;
0.5mL，1.5mL EP管。
（2）溶液配制
PBS：用分析純試劑，millipore.html' target='_blank'>Millipore級別的純水配制，高壓滅菌。
PBST： PBS加入0.05% Tween-20，注意無菌操作。儲存于20-25°C，可存放一個月。
70%乙醇：分析純乙醇70mL，加入Millipore級別的純水至100mL。
30%乙醇：分析純乙醇30mL，加入Millipore級別的純水至100mL。
包被抗體（coating antibody，Primary antibody）：照U-Cytech說明書，加入雙蒸水溶解。使用時，用PBS稀釋50倍，每孔50μL。
封閉液：用PBS將試劑盒中的封閉存儲液（Blocking stock solution R）稀釋10倍，每孔200μL。
抗體稀釋液：注意，只是用來稀釋檢測抗體和酶聯(lián)親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲液（Dilution buffer R）稀釋10倍
檢測抗體（Biotinylated detector antibody，Secondary antibody）：照U-Cytech說明書，加入雙蒸水溶解。使用時，用抗體稀釋液稀釋100倍，每孔100μL。
酶聯(lián)親和素（Streptavidin-HRP conjugate）：照U-Cytech說明書，加入雙蒸水溶解。使用時，用抗體稀釋液稀釋100倍，每孔100μL。
AEC顯色液：照U-Cytech說明書，用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊（Substrate buffer capsule），然后加入3.3mL AEC儲存液（AEC stock solution），混合均勻后10mL每支分裝，-20oC保存。使用時，解凍，每孔加入100μL。
PHA刺激物：將儲存液（2mg/ml， Murex）分裝成20μL/EP管，-20°C長期凍存。使用時，加入980μL U-Cytech無血清培養(yǎng)基（或者1640基本培養(yǎng)基），成為工作液（40μg/mL，10倍終濃度），每孔加入10μL，終濃度4μg/mL。
U-Cytech無血清培養(yǎng)基：我們推薦無血清ELISPOT技術(shù)，它能排除血清的干擾，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，背景也更好。如果沒有，可以用含10% 血清的1640培養(yǎng)基代替。
2、ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序
（1）*天：ELISPOT包被程序
設(shè)計好試驗(yàn)，把每個孔要加入的內(nèi)容做成卡片，到時候就會從容很多。
每孔加入15μL 70%的乙醇預(yù)濕30秒。
注意：
未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的，經(jīng)過乙醇潤濕之后，顏色變暗，變成半透明狀，很容易觀察二者的區(qū)別。
加乙醇的時候，槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不到刺到PVDF膜。
有時候，加入的乙醇掛在孔壁上，這時要蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢滑落。乙醇一旦接觸到PVDF膜，就會在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。
15μL是經(jīng)過優(yōu)化的體積，它能保證剛好*浸潤整塊膜，而不會有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就會透過膜而積存在膜的背面，加深實(shí)驗(yàn)的背景。
加入100μL去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留。
按照試劑盒的使用說明，將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中，每孔加入50μL，4°C包被過。
（次日）傾倒包被液，用PBS洗滌5次，zui后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。
加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時。
傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。（也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存數(shù)周。）
（2）第二天：鋪細(xì)胞，加入刺激物，培養(yǎng)
整個實(shí)驗(yàn)設(shè)置一組正對照（PHA刺激），每一個細(xì)胞樣品（同一個捐獻(xiàn)者或者實(shí)驗(yàn)動物）要設(shè)一個負(fù)對照（不加刺激物），整塊板還要加一個背景負(fù)對照（不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑）。
填好實(shí)驗(yàn)卡片，用以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的安排和細(xì)胞及試劑的添加。每一個細(xì)胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個孔的重復(fù)（想要有統(tǒng)計學(xué)的意義，每個細(xì)胞/刺激物設(shè)4 個孔的重復(fù)）。
取出封閉好的板，準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前做的封閉，可以加入200μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復(fù)一次。
按照實(shí)驗(yàn)卡片的安排，加入不同濃度的細(xì)胞，100μL/well，細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻（要訣是加入細(xì)胞之后，不要再震動或者拍擊 ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會讓細(xì)胞更分散，實(shí)際情況剛好相反）。正對照的細(xì)胞濃度為1x105/well，實(shí)驗(yàn)組的樣品細(xì)胞濃度請自行調(diào)整。
加入100μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對照孔。
正對照孔加入10μL PHA，終濃度4ug/mL，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。
加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物（配制成10X終濃度，10μL/well）到實(shí)驗(yàn)孔。加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會讓刺激物在孔中混合均勻，實(shí)際上，通過擴(kuò)散，刺激物也會很快混合均勻。拍擊板子會讓細(xì)胞成圈的分布在孔的外周。
當(dāng)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18-24小時。注意在整個培養(yǎng)過程中避免移動、碰撞培養(yǎng)板。為了取得更好的結(jié)果，甚至開關(guān)培養(yǎng)箱的箱門也應(yīng)該禁止。因?yàn)榕鲎矔斐杉?xì)胞的移位，造成斑點(diǎn)的模糊、拖尾。
（3） 第三天：培養(yǎng)后操作
傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。
低滲法將細(xì)胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘。
每孔用200μLPBST洗滌10遍，洗滌zui后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干。
按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋檢測抗體，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測抗體，37°C 1小時。
每孔用200μL PBST洗滌5遍，洗滌zui后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
注意：
洗滌膜的背面，我們摸索出的辦法是，在一個淺托盤中盛上干凈的PBST，將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。注意，一定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜。
按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素，每孔加入100μL，37°C 1小時。
每孔用200μL PBST洗滌5遍，洗滌zui后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
照試劑盒的說明，解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。
待斑點(diǎn)生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置 10-30分鐘，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂。
將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，半點(diǎn)計數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，作統(tǒng)計分析。
三、 ELISPOT檢測的標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制
由于ELISPOT檢測的超高靈敏度，它的斑點(diǎn)形成容易受到諸多因素的影響。如果不采取措施，檢測的重復(fù)性很難保證，不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作者、甚至同一操作者不同批次之間的結(jié)果也很難進(jìn)行直接比較和匯總。
1、ELISPOT技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化
為了提高ELISPOT檢測結(jié)果的可重復(fù)性，增加實(shí)驗(yàn)的可信度，必須建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范（Janetzki S et. al.， 2005）。標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范不僅僅是一些實(shí)驗(yàn)操作，更是一個系統(tǒng)工程，需要提升到實(shí)驗(yàn)室管理與制度架構(gòu)上來建設(shè)。這包括實(shí)驗(yàn)室制度的建立，實(shí)驗(yàn)人員的培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)程序的建立和標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑、耗材的選擇與標(biāo)準(zhǔn)化等等。單就實(shí)驗(yàn)流程而言，標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范從實(shí)驗(yàn)樣品的采集階段就開始了，一直延續(xù)到整個實(shí)驗(yàn)的結(jié)束，即數(shù)據(jù)分析處理的完成（Janetzki S et. al.， 2005）。
影響到ELISPOT斑點(diǎn)頻率的因素很多，但是zui重要的影響因素可以歸結(jié)為三個：其一，被檢測細(xì)胞的狀態(tài);其二，整個實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞所接觸到的內(nèi)毒素以及其它敏感成分;其三，刺激物的質(zhì)量與純度。
（1） 細(xì)胞狀態(tài)
這是一個很難量化的主觀概念。盡管量化困難，但是長期做ELISPOT檢測的實(shí)驗(yàn)者都能夠感覺到：凡是狀態(tài)好、活力高、功能保持完好的細(xì)胞，ELISPOT檢測時必定背景干凈，負(fù)對照斑點(diǎn)少，實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)圓潤漂亮，并且結(jié)果的可重復(fù)性好，數(shù)據(jù)真實(shí)可信。反之亦然。
如何保持細(xì)胞的良好狀態(tài)呢?根據(jù)不用的情況有不用的應(yīng)對措施。做ELISPOT檢測的細(xì)胞可以分為兩類，一類是新鮮分離的細(xì)胞，還有一類是經(jīng)過凍存復(fù)蘇的細(xì)胞。對于前一類細(xì)胞，為讓細(xì)胞始終處于*的狀態(tài)，需要采取經(jīng)過優(yōu)化的、標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞分離方法，經(jīng)量減少機(jī)械損傷（比如通過機(jī)械方法將小鼠的脾臟分解成單個細(xì)胞）和有毒的化學(xué)物質(zhì)（比如淋巴細(xì)胞分離液）對細(xì)胞的損害。而對于凍存復(fù)蘇的細(xì)胞，情況就更加復(fù)雜了。凍存與解凍對細(xì)胞本身就是很大的傷害。在細(xì)胞凍存中還會使用一些保護(hù)劑（比如DMSO），能減少凍存對細(xì)胞的傷害，但是這些保護(hù)劑本身就具有生物毒性，也會傷害細(xì)胞，影響細(xì)胞的狀態(tài)?？墒钦f，ELISPOT技術(shù)對細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇提出了更加嚴(yán)格的要求，不單單要求細(xì)胞的存活率高，還要求細(xì)胞的免疫功能在凍存前后不發(fā)生改變。因此，傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存、復(fù)蘇方法已經(jīng)不能適應(yīng)新的要求了。國外較早開展這方面的研究，從理論與實(shí)踐上已經(jīng)摸索出了一套行之有效的適應(yīng)ELISPOT功能檢測要求的細(xì)胞凍存、復(fù)蘇方法，可以保證很高的存活率（90%），并且斑點(diǎn)形成細(xì)胞SFC頻率保持不變（Maecker HT et. al.， 2005）。有些公司已經(jīng)把細(xì)胞凍存、復(fù)蘇程序經(jīng)過優(yōu)化而固定下來了，還開發(fā)了相應(yīng)的細(xì)胞凍存液，可以對細(xì)胞提供額外的保護(hù)。比如荷蘭U-Cytech公司推出的凍存液，專門針對做ELISPOT檢測的細(xì)胞，輔以標(biāo)準(zhǔn)化的凍存、復(fù)蘇程序，效果。
（2）內(nèi)毒素
內(nèi)毒素，即使是很低的濃度，也可以非特異性的刺激T淋巴細(xì)胞，使其分泌細(xì)胞因子。所以它對ELISPOT斑點(diǎn)頻率有著非常大的影響?？刂?/span> ELISPOT檢測中的活細(xì)胞所接觸到的內(nèi)毒素，要從各個關(guān)口嚴(yán)格控制。zui先控制的是ELISPOT試劑，要選擇口碑好的、產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低的產(chǎn)品。其次要控制培養(yǎng)基和血清。選購低內(nèi)毒素的產(chǎn)品，每一批次要做驗(yàn)證。zui后，要控制整個實(shí)驗(yàn)操作，做到嚴(yán)格無菌。特別指出的是血清，除了含有內(nèi)毒素，會增加負(fù)對照的斑點(diǎn)數(shù)目之外，還可能含有其它未知ELISPOT敏感成分，或者增加或者抑制斑點(diǎn)的生成。這在以往的報道中已經(jīng)屢見不鮮。為了*解決這一問題，采用無血清ELISPOT技術(shù)。即在ELISPOT刺激孵育中使用不含血清的培養(yǎng)基。目前，適用于人的PBMC細(xì)胞的無血清培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成熟，荷蘭U- Cytech公司開發(fā)了專門針對于人的PBMC細(xì)胞的ELISPOT無血清培養(yǎng)基，化學(xué)成分*限定，和ELISPOT兼容，*消除了血清對檢測的干擾作用。
（3）刺激物
選擇特異性的刺激物，有一個原則，那就是：成分盡可能簡單，純度盡可能高。所有*T細(xì)胞表位肽。它的成分簡單，特異性也。但是由于涉及到 MHC分子類型匹配的問題，如果不知道實(shí)驗(yàn)對象的MHC類型的話，可能要多選擇幾個T細(xì)胞表位肽，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)效果。其次推薦重疊多肽池。如果沒有抗原蛋白的 T細(xì)胞表位信息，也無相應(yīng)的文獻(xiàn)可以參考，那選擇重疊多肽池。目前的生物信息學(xué)有了長足的發(fā)展，可以幫我們預(yù)測蛋白質(zhì)序列上潛在的T細(xì)胞表位肽，根據(jù)預(yù)測的結(jié)果，在潛在的T細(xì)胞表位肽附近和成一系列的重疊多肽，混合成多肽池，也能對特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)作出有效刺激。以上兩類多肽都是人工合成的，特別要注意合成的純度（在90%以上，越純越好）以及合成過程中的質(zhì)量控制，注意避免內(nèi)毒素的污染。再次一級的刺激物是重組蛋白。注意，在大腸桿菌中重組表達(dá)的蛋白質(zhì)*不可用。因?yàn)樗械拇竽c桿菌成分以及內(nèi)毒素高到讓人無法接受的水平。是選擇在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)，它與ELISPOT的相容性*。昆蟲桿狀病毒載體表達(dá)的蛋白純度比較高，也可以使用。如果使用酵母載體表達(dá)的蛋白，需要多做驗(yàn)證，有時候效果也會比較好。如果實(shí)在沒有辦法獲得化學(xué)成分單一且已知的抗原刺激物而被迫使用成分未知的提取物的話，一定要注意多做驗(yàn)證，多做對照，多做重復(fù)孔。一般來說，這類刺激物會產(chǎn)生很多非特異性的斑點(diǎn)，在不同的實(shí)驗(yàn)對象個體之間會產(chǎn)生很大的差異，屬于不得已而為之。
2、ELISPOT檢測的質(zhì)量控制
僅僅只有標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范，不同實(shí)驗(yàn)者、不同實(shí)驗(yàn)室的ELISPOT結(jié)果還無法直接相互比較。為了做到這一點(diǎn)，還需要有一種定量的質(zhì)控系統(tǒng)。目前，在上的艾滋病疫苗項(xiàng)目需要在不同的國家、不同的實(shí)驗(yàn)是共同實(shí)施完成。為了評估疫苗的效果，在做ELISPOT質(zhì)量控制時，采取了核心參比實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的方法（Janetzki S et. al.， 2005）。即讓分布在各個地方的前線實(shí)驗(yàn)室將有代表性的樣品細(xì)胞凍存，運(yùn)輸?shù)胶诵膶?shí)驗(yàn)室，核心實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一對代表樣品做ELISPOT檢測，以這個檢測結(jié)果和各個實(shí)驗(yàn)室自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作比較和校正，然后匯總校正過的全局實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這種定量質(zhì)控的方式可以稱之為“收上來”的質(zhì)控方式。還有一種相對的定量質(zhì)控方式。即在一個核心實(shí)驗(yàn)室制備號標(biāo)準(zhǔn)品（包括標(biāo)準(zhǔn)刺激物和凍存細(xì)胞），然后分發(fā)到參與質(zhì)量控制的各個前線實(shí)驗(yàn)室。各個實(shí)驗(yàn)在做ELISPOT檢測的同時也順帶做上標(biāo)準(zhǔn)品的檢測。如果標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在預(yù)先設(shè)定的范圍之內(nèi)，那么前線實(shí)驗(yàn)室的該批ELISPOT檢測結(jié)果就是可信的，可接受的。如果各個前線實(shí)驗(yàn)室的檢測都以同一種標(biāo)準(zhǔn)品做質(zhì)控，并且在質(zhì)控范圍之內(nèi)，那么這些實(shí)驗(yàn)室之間的ELISPOT結(jié)果就是可以相互比較的，能夠共同參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。
ELISPOT數(shù)據(jù)處理與自動讀板設(shè)備
ELISPOT檢測的zui終數(shù)據(jù)是細(xì)胞頻率，即在細(xì)胞群體中，受某種特異性抗原的刺激而分泌某種細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞的比例。細(xì)胞的總數(shù)在一開始已經(jīng)技術(shù)過了。需要統(tǒng)計的是陽性細(xì)胞（也稱斑點(diǎn)形成細(xì)胞spot forming cell SFC）數(shù)目。根據(jù)以前的技術(shù)研究，我們可以肯定，每一個ELISPOT斑點(diǎn)對應(yīng)*一個陽性細(xì)胞。所以ELSPOT數(shù)據(jù)處理zui重要的工作就是進(jìn)行斑點(diǎn)計數(shù)。
手工計數(shù)一般是使用雙筒解剖鏡，在放大25倍的解剖鏡下，一個孔的底板剛好覆蓋一個完整的視野。實(shí)驗(yàn)操作人員手持按壓式的計數(shù)器，對孔內(nèi)的斑點(diǎn)逐一計數(shù)。手工計數(shù)zui大的優(yōu)點(diǎn)就是可以利用人腦的智慧與經(jīng)驗(yàn)：比如可以適應(yīng)各種大小的斑點(diǎn)，排除各種假陽性的斑點(diǎn)，能辨認(rèn)復(fù)雜的背景下的模糊的斑點(diǎn)，等等。但是手工計數(shù)也有致命的弱點(diǎn)，那就是工作乏味，費(fèi)時費(fèi)力。尤其是在實(shí)驗(yàn)規(guī)模比較大、斑點(diǎn)頻率比較高的時候（比如有數(shù)快板，每孔有數(shù)百乃至上千個斑點(diǎn)），人工計數(shù)簡直就是實(shí)驗(yàn)者的噩夢!此外，人工計數(shù)的主觀差異也是一個問題，實(shí)驗(yàn)者很難在整個計數(shù)過程中保持*相同的斑點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)。
要實(shí)現(xiàn)這個過程的自動化，我們很容易想到顯微照相技術(shù)、圖像處理技術(shù)以及計算機(jī)人工智能技術(shù)。把它們綜合到一起，這就是ELISPOT自動讀板設(shè)備。1992年，德國萊卡公司推出了*臺ELISPOT自動讀板儀。然而市場卻沒打開，因?yàn)槟菚r的ELISPOT技術(shù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有現(xiàn)在這么普及，對自動讀板儀的需求還不足以支撐起一個商業(yè)化的產(chǎn)品。
四、 ELISPOT的應(yīng)用與展望
ELISPOT技術(shù)的*優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)讓它在抗原特異性T細(xì)胞免疫學(xué)研究上*。它是當(dāng)今*能夠檢測到到百萬分之一陽性細(xì)胞率的檢測技術(shù)。如此高的靈敏度就連流式細(xì)胞技術(shù)（細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色）和tetramer技術(shù)也*（Letsch A et. al.， 2003）。此外由于淋巴細(xì)胞的凍存復(fù)蘇問題也得到了的解決，經(jīng)過凍存復(fù)蘇的細(xì)胞并不喪失免疫功能（Maecker HT et. al.， 2005;Kvarnstrom M et. al.， 2004）。這一點(diǎn)對臨床試驗(yàn)非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣。如果試驗(yàn)牽涉全國乃至多個臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，病人血樣可凍存、運(yùn)輸?shù)降胶诵膶?shí)驗(yàn)室儀器檢測。同理，一個實(shí)驗(yàn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)對照品可分裝凍存，運(yùn)輸?shù)讲煌膶?shí)驗(yàn)室檢測，以資比較。
所以，ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用在國外已經(jīng)*普及。凡是需要進(jìn)行免疫學(xué)檢測的地方機(jī)會都可以應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)。粗略的劃分可以分為以下幾類：
1、疫苗研究開發(fā)
ELISPOT檢測已經(jīng)成為評價疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)zui有效的指標(biāo)（Harrop R et. al.， 2004）。我們知道，疫苗的保護(hù)效果可以分為兩部分：體液免疫保護(hù)和細(xì)胞免疫保護(hù)。有效的疫苗不僅能夠激發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫，也能激發(fā)有效的細(xì)胞免疫（Holmgren J et. al.， 1992b）。對于某些持續(xù)性感染的疾病，疫苗的細(xì)胞免疫保護(hù)效果甚至居于主要地位。zui的例子是艾滋病疫苗開發(fā)（Lee FK et. al.， 1989;Stratov I et. al.， 2004）。由于艾滋病毒的超級突變能力，體液免疫往往會被病毒輕易逃避，體內(nèi)真正控制病毒復(fù)制的因素是細(xì)胞免疫反應(yīng)，即清除受感染的CD4+細(xì)胞（Vahlne A et. al.， 1991;Maecker HT et. al.， 2003）。除了預(yù)防性的疫苗開發(fā)之外，治療性疫苗也是目前疫苗開發(fā)的重要組成部分。治療疫苗的主要功能在于重新激發(fā)起人體內(nèi)被抑制的針對病源細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前的治療儀表包括乙肝疫苗、黑色素瘤疫苗（Zarour HM et. al.， 2003）、肝癌疫苗（Chi KH et. al.， 2005）、自身免疫疫苗等等。
2、臨床指導(dǎo)
許多疾病的發(fā)生、發(fā)展都是與人體的免疫系統(tǒng)異常相關(guān)聯(lián)的。比如各種自身免疫疾病：I-型糖尿病（Karlsson Faresjo MG et. al.， 2005），多發(fā)硬化癥（Moldovan IR et. al.， 2005）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Kalsi JK et. al.， 2004）、牛皮癬/銀屑病（Sigmundsdottir H t. al.， 1997）、結(jié)核病（Restrepo BI 2004）、自身免疫性心肌炎（Maier R et. al.， 2005）、自身免疫性感音性耳聾（Solares CA et. al.， 2005）、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Klatt T et. al.， 2005）、.視神經(jīng)脊髓炎（Correale J et. al.， 2004）等等。在這些疾病的診斷、病因查找中，ELISPOT檢測可以提供非常重要的信息，甚至成為zui終指標(biāo)。比如在I-型糖尿病的診斷中，ELISPOT可以提供zui終的判定依據(jù)（Meierhoff G et. al.， 2002）。而對有糖尿病史的家族，做ELISPOT檢測，甚至可以在疾病發(fā)作之前5-10年作出預(yù)測（Karlsson Faresjo MG et. al.， 2005;Seissler J et. al.， 2001）。這對于指導(dǎo)病人的日常生活，提高治療效果有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。
ELISPOT除了直接用于臨床診斷，還可以對于治療和用藥提供重要的參考信息。比如對于器官移植者，用ELISPOT監(jiān)視患者體內(nèi)的免疫排斥反應(yīng)，可以有針對性的用藥，避免盲目的使用免疫抑制劑（Tung TH et. al.， 2005）。這對于增加移植手術(shù)的成功率，延長移植器官的存活率，提高病人的生活質(zhì)量意義重大（van Besouw NM et. al.， 2005;Tambur AR et. al.， 2005）。類似的ELISPOT免疫監(jiān)視也見于基因治療的病人（Whiteside TL et. al.， 2003）。再比如對于乙肝病人，如果用ELISPOT檢測觀者所處的免疫階段（急性期、平穩(wěn)期、耐受期、恢復(fù)期），有針對的用藥，同時評估各種藥物對于觀者的治療效果，遠(yuǎn)優(yōu)于盲目治療（Fan ZP et. al.， 2004;Lohr HF et. al.， 1998）。
3、基礎(chǔ)研究
ELISPOT技術(shù)本來就是在基礎(chǔ)研究中創(chuàng)立和發(fā)展起來的。生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究日新月異，ELISPOT有不可磨滅的功勛。但也正是由于基礎(chǔ)研究的發(fā)展快，ELISPOT的應(yīng)用廣，所以才難于分門別類?？陀^地說，在一切免疫學(xué)研究的前沿領(lǐng)域，ELISPOT都是zui有力的研究工具之一。比如研究人體的免疫系統(tǒng)功能，研究Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析（Ott PA et. al.， 2005），研究機(jī)體的過敏機(jī)制（Bordignon V et. al.， 2005;Chapoval SP et. al.， 2002），研究癌癥的免疫機(jī)制（Andersen MH et. al.， 2005;Alix-Panabieres C et. al.， 2005），研究和篩選有效的T細(xì)胞表位肽（Anthony DD et. al.， 2003）等等等等，可謂名目繁多，不一而足。ELISPOT技術(shù)在基礎(chǔ)研究方面所受的限制不在于技術(shù)本身，而在于我們的想象能力與創(chuàng)新思維。
展望未來的ELISPOT技術(shù)，會在技術(shù)進(jìn)步本身和應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展兩個方面都有長足的發(fā)展。就技術(shù)本身來說，更好的底板材料，無血清檢測技術(shù)，雙因子檢測，多因子熒光檢測，都會逐漸成熟起來。ELISPOT應(yīng)用領(lǐng)域的拓展可以從每年發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)量變化上反映出來。圖顯示了美國國立衛(wèi)生院生物信息中心論文數(shù)據(jù)庫（NCBI PubMed）收錄的自ELISPOT創(chuàng)立以來年度論文的數(shù)目。該圖反映了ELISPOT技術(shù)經(jīng)歷起起伏伏，終于發(fā)揚(yáng)光大，成為免疫學(xué)主流檢測技術(shù)的歷程。