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士鋒生物Native-PAGE常見問題
最近更新時間：2013-8-9
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14KB
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1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時預電泳是怎么回事的?預電泳時要加6×DNA上樣緩沖液嗎?電泳1-2小時再加結合反應產物嗎?
預電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發(fā)劑,提高分辨率,不加任何物質,一般30-60分鐘后加樣電泳.
2. 銀染的步驟是什么?銀染的關鍵因素是什么?
步驟是:
（1） 固定:10%冰乙酸30min.
（2） 清洗:雙蒸水沖洗凝膠2次,每次1min.
（3） 染色:染色液（1g硝酸銀,1.5ml 37%甲醛,1l 雙蒸水.現(xiàn)配）染色30min.
（4） 清洗:迅速洗凝膠1次.
（5） 顯影:30g碳酸鈉,1.5ml 37%甲醛,200μl 10mg/l 硫代硫酸鈉.顯影至清晰帶紋出現(xiàn).
成功銀染的關鍵因素包括:
（1） 用超純水（比如,NANOpure或Milli-Q純化）或者是雙蒸水作銀染.
（2） 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級的碳酸鈉.
（3） 在染色后,水清洗所用時間的長短很重要,用不超過5-10秒的時間清洗膠,然后放入顯色溶液中,一般在水里浸一下就好.
（4） 甲醛和硫代硫酸鈉（400μl/1ml）在使用前,及時加入到顯色液中.
（5） 在使用前及時配染色液.
3. 變性PAGE的上樣緩沖液配方?如何準備上樣的蛋白?是將細胞用超聲破碎,還是用細胞裂解液,大多細胞裂解液中均含有SDS,不知有沒有用于非變性PAGE的裂解液.具有操作步驟是什么?
非變性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上樣緩沖液可以用普通的loading buffer,含有Tris,溴芬蘭以及甘油即可,甘油是主要的沉淀作用成分.都可以自己配.細胞超聲即可,超聲后離心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer為1*TBE,用的running buffer也是1*TBE.還有一點就是要在配gel時考慮能使蛋白多聚體穩(wěn)定的因素.
4. 做了naive---PAGE沒有條帶,蛋白質是純品,分子量很大,怎么回事呢?
因為分子量很大,8%的膠濃度較合適.加樣時加個marker,可以檢測膠制備是否有問題.銀染方法比較靈敏,如果蛋白是一種酶,且可使某種底物顯色的話,可以用活性染色試試,更靈敏.