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士鋒生物蛋白測序的原理、步驟、以及N端測序服務(wù)的注意事項(xiàng)
最近更新時間：2013-8-22
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>7.4KB
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蛋白測序的主要策略是采用化學(xué)或者酶消化方法將多肽鏈拆分，然后測定氨基酸殘基含量和組成。本文詳述了蛋白質(zhì)測序的概念，蛋白測序的步驟以及蛋白N-端測序服務(wù)等。
一、概念
當(dāng)前，所謂蛋白質(zhì)測序，主要指的是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（Primary structure）包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。
蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬個不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。
二、測定步驟
1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體;可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈（亞基）.
2 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。
3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的β-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。
二硫鍵的切割與保護(hù)（元素后數(shù)字為下標(biāo)）
a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆
-CH2SO3H
b、還原+氧化 不可逆
[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等
-S-CH2-COOH
c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
-R1-S-S-R2 + HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力;應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。
巰基（-SH）的保護(hù)
作用：這些反應(yīng)（見下圖）可用于巰基的保護(hù)。
4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比（如下圖）
5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端
多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸（amino-terminal）和C-端氨基酸（Carboxyl-terminal） 。在肽鏈氨基酸順序分析中，zui重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法），C末端分析法（肼解法;酶降解法;硼氫化鋰法）。
6 多肽鏈斷裂成多個肽段?？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。
7 測定每個肽段的氨基酸順序
8 確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。
9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。
三、蛋白質(zhì)N-端測序服務(wù)
幾乎所有的蛋白合成都起始于N-端，蛋白質(zhì)N-端的序列組成對于蛋白質(zhì)整體的生物學(xué)功能有著巨大的影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)的半衰期，同時關(guān)聯(lián)著蛋白亞細(xì)胞器定位等，這些與蛋白的功能和穩(wěn)定息相關(guān)，對蛋白進(jìn)行N-端測序分析，有利于幫助分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。
目前對蛋白N端測序主要分類兩大類，其一為非質(zhì)譜技術(shù)，例如經(jīng)典的Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對應(yīng)蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列;其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用的長處和制約之處，目前，市面上采用的，依然是基于經(jīng)典的Edman降解法原理，利用美國ABI公司Procise491蛋白序列測序系統(tǒng)進(jìn)行蛋白N-端測序。
蛋白質(zhì)N-端測序服務(wù)說明
基于Edman降解法原理進(jìn)行蛋白質(zhì)N-端測序，從理論上不可避免的受到兩種條件制約，會很大程度上影響蛋白測序質(zhì)量：
1、樣品純度不能太低，經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為純度大于90%的蛋白才適用于測序反應(yīng)。
2、N端封閉或糖基化的蛋白質(zhì)難以進(jìn)行Edman反應(yīng)，無法測序。
蛋白質(zhì)合成是從N末端開始的，因此分析蛋白質(zhì)合成是從N末端序列對蛋白序列分析很重要，蛋白質(zhì)N端序列主要是通過Edman降解法和質(zhì)樸技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。