蛋白質(zhì)鑒定方法銀染法和考馬斯亮藍染色法

最近更新時間：2013-8-26

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相關(guān)產(chǎn)品：

 常用的蛋白質(zhì)染色試劑分為已考馬斯亮藍為代表的有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中考馬斯亮藍染色法的應(yīng)用較為廣泛，現(xiàn)將其與其他的蛋白質(zhì)染色方法（主要是銀染法）作一比較，幫助大家更好地去選擇合適的蛋白質(zhì)染色方法。

蛋白質(zhì)的染色常用的有4類：有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中有機試劑染色以考馬斯亮藍染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）為代表，在蛋白質(zhì)分析中常用，但對低豐度蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)較差;銀染靈敏度雖高，卻常與質(zhì)譜不兼容;熒光染色以SYPRO試劑為主，蛋白質(zhì)檢測靈敏度高，能兼容質(zhì)譜，但由于需要配備特殊的檢測儀器及試劑的昂貴，未被作為常規(guī)方法使用;而同位素顯色則存在安全性和操作局限性等問題。因此，篩選簡便、節(jié)約、檢測靈敏度高、質(zhì)譜兼容的蛋白質(zhì)著色法是蛋白質(zhì)組研究所需。由于考馬斯亮藍染色法的廣泛運用，近年來就考馬斯亮藍染色法在提高其靈敏性方面研究者們作了許多改進，方法眾多，評價不一。

我們在作雙向凝膠電泳時，將常用的幾種考馬斯亮藍染色法及銀染進行了比較，并就其染色影響因素作出分析。

試劑

固相pH梯度干膠條（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。硫酸銨及磷酸均購自成都科龍試劑廠。AgNO3為Sigma公司出品。Protein molecular weight marker #SW0431為MBI公司出品。甲醛、Na2S2O3與Na2CO3分別為成都天華科技股份有限公司、重慶北碚化學試劑廠和天津市塘沽鵬達化工廠產(chǎn)品。

儀器

IPGphor等電聚焦儀、proTEANⅡ垂直電泳儀、Power PAC1000電泳儀、加樣溶脹槽、GS-800 Calibrated Densitometer掃描儀、PDQuest凝膠圖像分析軟件均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

細胞總蛋白質(zhì)的提取

取4份經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)的急性早幼粒白血病細胞株（NB4）1×107細胞各重懸于350 μl蛋白質(zhì)裂解緩沖液中（8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚蘭），置冰浴中超聲裂解，靜置30分鐘，15500×g離心30分鐘，取上清，進行蛋白質(zhì)定量。

單向定量電泳

取蛋白質(zhì)分子量標準物，*次按1∶2稀釋后，以后按1∶3倍比例逐級稀釋，經(jīng)4級稀釋后，取15μl上樣液上樣，β-半乳糖苷酶上樣量依次分別為1μg、 0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠單向電泳，同時電泳4份膠，顯色以確定染色靈敏度。

雙向電泳

取 300μl樣品液沿水化盤中槽的邊緣自左向右線性加入，將17cm IPG膠條膠面朝下置于槽中，靜置45分鐘后覆蓋礦物油，在20℃溶脹11～16小時。溶脹后的膠條置于等電聚焦盤中，在Protean IEF Cell中進行等電聚焦，溫度設(shè)置為20℃，電壓模式設(shè)置為：快速升壓，250 V，0.5小時;500 V，0.5小時;10000 V，60000 Vh（伏特×小時）。取IEF后的IPG 膠條，先后分別置于含DTT平衡液1（6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L）及含碘乙酰胺平衡液2（同平衡液1，但其中DTT換為2.5g/L 碘乙酰胺）中輕微搖蕩各10分鐘。將平衡好的IPG 膠條置于預(yù)先灌制的12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，封固，在15℃低溫水循環(huán)條件下，15 mA/gel電泳15分鐘，然后以25mA/gel恒流電泳。

顯色

取出SDS-聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)超純水清洗2次，每次1分鐘，4塊膠分別按4種不同的染色方法顯色。下列每步操作皆在搖床上進行。4種染色法成份組成及操作如下： ①傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法：清洗后的凝膠經(jīng)固定液（45.4%甲醇、4.6%乙酸）固定1小時，隨后用染色液（45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250）著色過，再經(jīng)洗脫液（5%甲醇、7.5%乙酸）過脫色至背景清晰。②膠體考馬斯亮藍染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）染色法：凝膠先經(jīng)超純水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液（1.6%磷酸、8%硫酸銨、0.02% CBB G250、20%乙醇）著色過，洗脫液為超純水，換液3～4次直至背景清晰。③改良考馬斯亮藍染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）染色法[6];操作方法同膠體考馬斯亮藍染色法，只是染色液組成不同（0.12% CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇），著色1小時即可。④銀染（silver staining）：凝膠漂洗后先被固定液（50%甲醇+ 5%乙酸）固定1小時，隨后分別用50%甲醇和超純水清洗各10分鐘，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分鐘，超純水清洗2次，每次1分鐘，再用預(yù)冷的0.15% AgNO3著色20分鐘，超純水再次清洗2次，每次1分鐘，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛顯色20～30秒，當溶液變黃以后除去，換新鮮的溶液后繼續(xù)顯色直至顯色適度后，以5%乙酸終止顯色。

成像、分析、質(zhì)譜鑒定

脫色后，凝膠經(jīng)GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，用PDQuest軟件進行分析。切取蛋白質(zhì)點，胰酶消化，行質(zhì)譜鑒定。

結(jié)果

4種染色法的蛋白質(zhì)檢測靈敏性分析

β-半乳糖苷酶的上樣量依次分別為1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。經(jīng)傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色后的條帶在62ng水平隱隱可見;而膠體考馬斯亮藍染色法的靈敏度稍高，62ng條帶明顯可見;改良考馬斯亮藍染色法的效果更好些，在15.6ng水平可見條帶的顯示;而銀染法靈敏度zui高，在15.6ng水平可見清晰條帶的顯現(xiàn)，同時在4ng可見隱約條帶。4種染色法的比較顯示，靈敏度zui高的是銀染法，可達納克級水平，其次為改良考馬斯亮藍染色法，10納克級蛋白質(zhì)能被檢測。而膠體考馬斯亮藍染色法和經(jīng)典考馬斯亮藍染色法稍差，檢測水平僅達幾十納克。

4種染色法的雙向電泳蛋白質(zhì)點顯示比較

來自NB4細胞的全蛋白經(jīng)pH 3-10NL的等電點梯度分離，SDS-PAGE 二維垂直電泳后被3種考染法著色成像的顯示可以看出傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)zui少，膠體考馬斯亮藍染色法的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)較多，而改良考馬斯亮藍染色法的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)更多。凝膠背景以后二者為更清晰。經(jīng)PDQuest軟件進行分析，3幅圖的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)數(shù)分別為483、679、890。NB4細胞的全蛋白經(jīng)pH 5-8 IPG分離，分別經(jīng)改良考馬斯亮藍染色法與銀染法著色成像的蛋白點顯示，二者上樣量一致，蛋白點的顯現(xiàn)數(shù)量相當，但銀染的蛋白點明顯顯示著色重。這與單向電泳的效果相同。

4種染色法的可操作性比較

在比較其蛋白質(zhì)檢測靈敏性的同時，對染色法的操作簡便性、安全性以及蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定的成功率也作了對比。比較顯示，考馬斯亮藍染方法簡便，但耗時較長，經(jīng)改進后可以做到無毒操作，質(zhì)譜兼容性較高。銀染步驟繁多，但耗時短;操作過程中有甲醇、甲醛等毒性物的接觸，質(zhì)譜兼容性低。即使我們選擇的銀染法被文獻報道為質(zhì)譜兼容的，但仍然表現(xiàn)為低的蛋白鑒定率，不及考馬斯亮藍染。

討論

凝膠染色方法對蛋白質(zhì)分辨率的影響

提高雙向凝膠電泳的分辨率是蛋白質(zhì)組學研究尚待解決的課題及技術(shù)發(fā)展方向，影響蛋白質(zhì)分辨率的因素較多，其中凝膠染色方法對蛋白質(zhì)分辨率的影響不可忽視，它影響了實驗的顯像結(jié)果，直接干預(yù)了后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。目前，在蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的是考馬斯亮藍染色法和銀染法兩種。

考馬斯亮藍（Coomassie brilliant blue，CBB G-250）的化學名稱為二甲花青亮藍，偏酸性，與蛋白質(zhì)的堿性基團結(jié)合，顏色由棕黃色轉(zhuǎn)為深蘭色?？捡R斯亮藍染色法可以達到微克級檢測水平，著色程度與蛋白量的線性動力學相關(guān)范圍廣，適合定量分析。該法由于較低的成本、使用方便及與下游的質(zhì)譜鑒定技術(shù)的良好相容性，而得到了非常廣泛的使用。然而微克級的檢測水平使它漏檢了相當多的低豐度蛋白質(zhì)，日益成為蛋白質(zhì)組學的瓶頸，因此大量提高染色靈敏度的研究及各種染色液的配方和方法應(yīng)運而生，經(jīng)文獻報道的方法眾多，評價不一。我們的試驗選擇了3種常用的考馬斯亮藍染色法進行比較，測得傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法的靈敏度可達幾百納克，膠體考馬斯亮藍染色法能檢測到幾十納克蛋白，改良考馬斯亮藍染色法則可達幾納克蛋白水平?？捡R斯亮藍染色法經(jīng)過改進能獲得高的蛋白質(zhì)檢測靈敏度，甚至可與銀染媲美。

銀染法是利用銀離子與氨基酸共價結(jié)合，還原劑的加入使與膠內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合的銀離子形成金屬銀而顯色。文獻報道檢測限度可低于1 ng的蛋白質(zhì)，其靈敏度比傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法高約100倍，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學研究，但銀染步驟復(fù)雜，繁瑣，且著色線性動力學的覆蓋范圍窄，導(dǎo)致蛋白質(zhì)差異顯示的不準確性，同時由于游離銀離子及相關(guān)試劑的存在，給后續(xù)分析及鑒定帶來一定的實際困難。我們的實驗只采用了一種銀染法，結(jié)果顯示銀染法的靈敏性高于所有考馬斯亮藍染色法，4 ng的蛋白質(zhì)條帶也能顯現(xiàn)，但蛋白質(zhì)鑒定成功率低。

蛋白質(zhì)檢測靈敏度的影響因素

蛋白質(zhì)著色顯示的靈敏性既取決于染色試劑，如上述分析，又與染色過程中涉及的有機溶劑及離子有關(guān)。在考馬斯亮藍染色法和銀染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有機溶劑的使用。甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白質(zhì)固定在凝膠中或阻滯它們在凝膠中擴散。同時也去除電泳過程中的干擾染色過程的物質(zhì)，如去垢劑、還原劑和緩沖液等成分。乙酸的作用既是輔助固定蛋白質(zhì)同時又維持染液的酸性度，以利于考馬斯亮藍與蛋白質(zhì)結(jié)合。他們的存在有利于獲得背景清晰、信噪比高的圖像。由于3種有機溶劑的相似作用，我們在膠體考馬斯亮藍染色法及改良考馬斯亮藍染色法里，保留乙醇作為*的固定清潔劑，用磷酸替代乙酸發(fā)揮酸化作用，結(jié)果顯示兩種考馬斯亮藍染色法獲得的圖像背景比傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法的要清晰，條帶也銳利。

在膠體考馬斯亮藍染色法中，酸性的乙醇介質(zhì)中加入硫酸銨，使得著色劑形成膠體染色顆粒，膠本身可不被顯著著色，蛋白染色靈敏度得以提高。而在改良考馬斯亮藍染色法中，在高酸、高離子環(huán)境下，蛋白質(zhì)的葡糖胺和天冬酰胺酸質(zhì)子化，更利于與染色劑發(fā)生結(jié)合。因此2種染色法呈現(xiàn)出背景清晰、蛋白檢測多的圖像，且在改良考馬斯亮藍染色法中由于高酸、高離子存在，靈敏度出現(xiàn)提高，幾接近銀染水平。

甲醛在銀染中發(fā)揮還原劑作用，使結(jié)合在蛋白質(zhì)上的銀還原而顯色。甲醛濃度影響銀染效果，濃度一般為400～500μl/L。甲醛濃度較高時膠顏色發(fā)黃，背景色混雜，難以發(fā)現(xiàn)目的點;濃度較低不僅染色時間延長，而且不易著色。銀的絡(luò)合劑硫代硫酸鈉防止自由銀離子還原為金屬銀，可減少非特異染色，降低背景染色，其濃度一般為0.1～0.2mg/L。該絡(luò)合劑用量過多，膠顏色過深;少則不足以螯合掉游離的銀離子，膠顏色發(fā)黑。

質(zhì)譜兼容性的影響因素

考馬斯亮藍G-250在一定的pH時，這種染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物被*解聚。適應(yīng)于蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定;而銀染使用的銀離子及醛類造成肽間的相互交連，影響膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解及洗脫，降低了蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的氨基酸序列覆蓋率，考馬斯亮藍染蛋白質(zhì)鑒定的成功率在60%～80%之間，遠高于銀染鑒定的成功率（30%～60%）;而我們的結(jié)果是，前者的質(zhì)譜鑒定成功率為50%，后者僅為5%。鑒于此，我們也在不斷地尋找新的方法，以提高銀染鑒定的成功率。

操作的安全性與簡便性

由于有機溶劑的相似作用，我們在改進的考馬斯亮藍染色法里，拋棄有毒的甲醇及氣味難聞的乙酸，同時在步驟上，我們采用染色和固定一步法進行，減少了*步固定的時間，僅用超純水清洗，縮短了整個染色及人與有毒物接觸的時間。結(jié)果顯示，兩種考馬斯亮藍染色法獲得的圖像背景不比傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法差。

通過我們的摸索及比較分析認為，用低毒的乙醇替代甲醇，采用高酸、高離子、快速而簡便的改良考馬斯亮藍染色法能獲得低背景、高靈敏度、兼容質(zhì)譜的蛋白質(zhì)顯示，能為蛋白質(zhì)組研究、雙向凝膠電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)分析提供質(zhì)量的保證。

綜上比較，作為蛋白質(zhì)染色的方法，考馬斯亮藍法操作便捷、兼容性高，但耗時較長。經(jīng)改良的考馬斯亮藍法的檢測靈敏性大大提高，甚至不輸銀染法。而銀染法雖然耗時短，但步驟較多，且兼容性低。

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