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士鋒生物Western blot中硝酸纖維膜和PVDF膜的選擇
最近更新時(shí)間：2013-8-29
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：10.5KB
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western blot中膜的選擇是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)，Western blot實(shí)驗(yàn)中一般可以選擇硝酸纖維膜（NC） 和PVDF膜，那NC膜和PVDF膜有什么區(qū)別呢?怎樣才能選擇zui恰當(dāng)?shù)碾s交膜進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)?zāi)?
NC膜 PVDF膜 尼龍膜的特點(diǎn)
解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型;硝酸纖維素膜（NC膜）是目前應(yīng)用zui廣的一種固相支持物，價(jià)格*;PVDF膜介于二者之間。
就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480-600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段;硝酸纖維素膜（NC膜）結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)80-100μg/cm2，對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng);PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)125-300μg/cm2。
就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合;硝酸纖維素膜（NC膜）依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固;PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng);硝酸纖維素膜較脆，易破碎;PVDF膜較強(qiáng)。
就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來;硝酸纖維素膜（NC膜）不能重復(fù)使用;PVDF膜可以重復(fù)使用。
western blot時(shí)該選擇NC膜還是PVDF膜?
硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜（NC膜）是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖 液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，雖然這其中的機(jī)制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜（NC膜）的這個(gè)特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同 孔徑的硝酸纖維素膜（NC膜）。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1mm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因此，我們通 常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用 0.45μm的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來看，zui重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜（NC膜）的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，市場(chǎng)上有些硝酸纖維素膜（NC膜）通常會(huì)還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。如果采用的是100%純度的硝酸纖維素， 保證了zui大的蛋白結(jié)合量，可達(dá)80-150μg/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無 需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次，膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會(huì)破損，不能反復(fù)使用。
PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來制造水管的。 PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)，zui初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測(cè)定，因?yàn)橄跛崂w維素膜在Edman試劑中會(huì)降解，所以就尋找了 PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結(jié)合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測(cè)序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與 硝酸纖維素膜一樣，可以進(jìn)行各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高，非 常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)行浸泡飽和1-5秒鐘。
使用PVDF膜時(shí)，一定要先用無水甲醇預(yù)處理，再在transfer buffer中平衡好才可以使 用（PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合）。經(jīng)過預(yù)處理的PVDF膜在轉(zhuǎn)膜時(shí)， 可以使用不含甲醇的transfer buffer。而使用NC膜時(shí)，有的需要用無水甲醇處理，有的則不必，直接用transfer buffer平衡好就可以了。
小結(jié)：綜上所述，可以根據(jù)硝酸纖維膜膜和PVDF膜的特點(diǎn)，以及實(shí)驗(yàn)的目的去選擇雜交膜，例如使用PVDF膜之前一定要經(jīng)過甲醇處理，當(dāng)抗原抗體識(shí)別識(shí)別需要維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，則選擇NC膜。