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士鋒生物IPTG誘導(dǎo)蛋白表達的原理.材料.實驗方法
最近更新時間：2013-8-30
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>10.5KB
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材料：
1、誘導(dǎo)表達材料：
（ 1 ） LB （Luria—Bertani））培養(yǎng)基：
酵母膏 （Yeast extract） 5g 蛋白胨 （Peptone） 10g
NaCl 10g 瓊脂 （Agar） 1-2%
蒸餾水 （Distilled water） 1000ml pH 7.0
適用范圍：大腸桿菌
（ 2 ） IPTG 貯備液：
2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中,0 . 22 μm 濾膜過濾除菌,分裝成1 mL /份,-20 ℃ 保存.
（ 3 ） l× 凝膠電泳加樣緩沖液：
50 mmol / L Tris -CI （ pH 6 . 8 ）
50 mmol / L DTT
2 % SDS （電泳級）
0.1 % 溴酚藍
10 % 甘油
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料：
1 ）酶溶法
（1）裂解緩沖液：
50 mmol / L Tris-CI （ pH 8 . 0 ）
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）.
（3）10 mg / mL 溶菌酶.
（4）脫氧膽酸.
（5）1 mg / mL DNase I.
2 ）超聲破碎法
（ 1 ） TE 緩沖液.
（ 2 ） 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：
100 mmol / L Tris-HCI （ pH 8 . 0 ）
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 % 溴酚藍
20 % 甘油
實驗方案：
1、外源基因的誘導(dǎo)表達：
（1）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因.
（ 2 ）按連接步驟連接目的基因和載體,并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌.
（ 3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落,提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜,DNA 序列測定,
確定無誤后進行下一步.
（ 4 ）如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子,則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時,使培養(yǎng)液的OD600達0.4-0.6 ,迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ;如果表達載體的原核啟動子為tac 等,則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時達到對數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L.繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h .
（ 5 ）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,作SDS -PAGE 檢測.
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化：
細(xì)菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學(xué)滲透等.前三種方法屬機械破碎法,并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,后三種方法在實驗室研究中應(yīng)用較為廣泛.下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟.
酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要對細(xì)菌類有作用,而其他幾種酶對酵母作用顯著.主要步驟為：
4 ℃ ,5000rpm 離心,15 min ,收集誘導(dǎo)表達的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 mL ）.棄上清,約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液,懸浮沉淀.