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士鋒生物大腸桿菌蛋白表達(dá)純化的策略
最近更新時(shí)間：2013-9-2
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>10.5KB
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大腸桿菌表達(dá)蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略?，F(xiàn)在，許多蛋白質(zhì)正在被發(fā)現(xiàn)而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質(zhì)分離出來后，進(jìn)行進(jìn)一步的研究來獲得。
分析蛋白質(zhì)的方法學(xué)現(xiàn)已極大的簡(jiǎn)化和改進(jìn)。必須承認(rèn)，蛋白質(zhì)純化比起DNA 克隆和操作來是更具有藝術(shù)性的，盡管DNA 序列具有異乎尋常的多樣性（因而它是*適合遺傳物質(zhì)的），但它卻有標(biāo)準(zhǔn)的物理化學(xué)性質(zhì)，而每一種蛋白質(zhì)則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學(xué)性質(zhì)（因而它具有執(zhí)行眾多生物學(xué)功能的用途）。正是蛋白質(zhì)間的這些物理性質(zhì)上的差異使它們得以能進(jìn)行純化，但這也意味著需要對(duì)每一種待純化的蛋白質(zhì)研發(fā)一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現(xiàn)已有多種方法可以利用，蛋白質(zhì)純化策略也已實(shí)際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當(dāng)普遍的事。可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)特別是Studier 等發(fā)展的以噬菌體T7RNA 聚合酶為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)使人們能近乎常規(guī)地獲得過表達(dá)（over-expression），表達(dá)水平可達(dá)細(xì)胞蛋白的2%以上，有些甚至高達(dá)50%。
一、可溶性產(chǎn)物的純化
（一）試劑準(zhǔn)備
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1、T7·Tag 抗體瓊脂
（二）操作步驟
1、100ml 含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml 預(yù)冷的B/W 緩沖液重懸。
2、重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
3、將結(jié)合T7·Tag 抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。
4、B/W 緩沖液平衡后樣品液過柱。
5、10ml B/W 緩沖液過柱，洗去未結(jié)合蛋白。
6、用5ml 洗脫緩沖液過柱，每次1ml，洗脫液用含150μl 中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE 分析。
7、將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數(shù)次。
8、用PEG 20000 濃縮蛋白。
（三）注意事項(xiàng)
蛋白在過層析柱前，要0.45μm 膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會(huì)有不溶物。
二、包涵體的純化
包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。包涵體形成是比較復(fù)雜的，與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無充足的時(shí)間進(jìn)行折疊，從而形成非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)的聚集體;此外，包涵體的形成還被認(rèn)為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH 值、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。細(xì)胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可融性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)
的聚集體，不具有生物學(xué)活性，因此要獲得具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體的主要成分就是表達(dá)產(chǎn)物，其可占據(jù)集體蛋白的40%～95%，此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、RNA 聚合酶、RNA、DNA、脂類及糖類物質(zhì)，所以分離包涵體后，還要采用適當(dāng)?shù)姆椒?/span>（如色譜法）進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的純化。
（一）試劑配制
1、緩沖液A：50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,2 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl。
2、緩沖液B：50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl，1%NP-40。
3.緩沖液Ⅰ：50 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100（V/V），4 mol/L 脲素。
4.緩沖液Ⅱ：50 mol/L Tris-HCl（pH8.0），2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，3% Triton X-100 。
5.緩沖液Ⅲ：50 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5%Triton X-100，2M 鹽酸胍。
6.緩沖液C：8 mol/L 脲素，10 mmol/Lβ-巰基乙醇，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），2mmol/L EDTA及脫氧膽酸鈉。
（二）操作步驟
1.用緩沖液A 漂洗菌體細(xì)胞（10ml/g）, 離心6000g×15min，收集菌體細(xì)胞，重復(fù)此步驟，將菌體細(xì)胞再在緩沖液A 中洗滌一次。
2.將漂洗過的菌體細(xì)胞懸浮于緩沖液B中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%，離心1500g×30min，收集包涵體沉淀。
3.將包涵體沉淀用緩沖液Ⅰ、緩沖液Ⅱ、緩沖液Ⅲ分別超聲洗滌一次，1500g 離心收集包涵體沉淀。
4.包涵體的溶解：用含高濃度脲素的緩沖液室溫放置30min，然后離心1500g×30min，留上清。將溶解后的蛋白質(zhì)適當(dāng)稀釋，磁力攪拌，透析過。
5.溶解后的包涵體蛋白可通過親和層析進(jìn)一步純化。