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士鋒生物雙向電泳各部分操作大全
最近更新時間：2013-9-4
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>17.6KB
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1. 總的策略
① 化學(xué)試劑純度要高，至少是分析級，目前國產(chǎn)試劑達(dá)不到純度要求 ② 使用去離子水（電導(dǎo)<2uS） ③ 尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鮮配制 ④ Deionize urea prior to use ⑤ 包含尿素的溶液加熱溫度不超過 37℃，否則會發(fā)生蛋白質(zhì)氨甲?；?/span>NBSp;過濾所有的溶液，使用干凈無灰塵的容器
2. 樣品制備
① 樣品提取緩沖液（裂解緩沖液）必須新鮮配制?；蛘叻盅b成 1ml，于-78℃冷凍保存， 裂解緩沖液一旦溶解不能再冷凍 ② 如有必要，在細(xì)胞裂解時加入蛋白酶抑制劑。注意：幾種蛋白酶抑制劑在 DTT 或b-巰基乙醇存在時失效 ③ 40000g 離心 1 小時以去除蛋白提取液中的不溶物
3. 灌膠
① 過硫酸銨溶液需新鮮配制。40%過硫酸銨溶液儲存于冰箱中只能使用 2-3天，低濃度過硫酸銨溶液只能當(dāng)天使用 ② TEMED 需在氮氣下儲存，每 6 個月?lián)Q一次 ③ 帶 U 型框的玻璃板需用疏水硅烷處理，避免膠聚合后與玻璃板粘連 ④ 水平 SDS 濃縮膠中加入甘油（37.5%）的目的是為了減少電內(nèi)滲 ⑤ 如果 SDS 膠結(jié)合于 GelBond PAG 膜上， GelBond PAG 膜需用去離子水洗 6 次，每次 10 分鐘， 以避免銀染過程中產(chǎn)生點托尾
膠聚合不*的可能原因解決辦法TEMED 或過硫酸銨時間太長替換 TEMED 和過硫酸銨SDS 膠：Tris 緩沖液的 pH 值用 HCl調(diào) Tris 緩沖液的 pH6.8 或 8.8膠從塑料支持膜上脫落的可能原因解決辦法膠聚合于 GelBond PAG 膜的疏水面膠必須聚合于 GelBond PAG 膜的親水面塑料支持膜選擇錯誤（如：用于瓊脂糖膠）選擇專門用于聚丙烯酰胺膠的支持膜GelBond PAG 膜過期不要使用超過一年的 GelBond PAG 膜膠結(jié)合于玻璃板上的原因解決辦法玻璃板沒有疏水處理玻璃板用疏水硅烷處理
4. IPG 膠條的水化
①PG 膠條需水化到 0.5mm 厚 ② IPG 膠條的的水化時間取決于水化緩沖液的組成。如果尿素（>8M）和去污劑（>1%）濃度過高，至少需水化 6 小時，過 ③采用 Multiphor II 做*向電泳時，水化后的 IPG膠條需用去離子水清洗，否則 IPG 膠條表面會有尿素結(jié)晶，干擾 IEF。（使用 IPGphor 時，IPG膠條水化后不必清洗） ④IPG 膠條水化時，其膠面與水化盤或膠條槽之間避免產(chǎn)生氣泡。采用膠條槽水化時，膠條上需覆蓋硅油以防水化液揮發(fā)
5. *相 IEF
①采用樣品杯上樣：樣品體積不能少于 20μl 樣品在陰極或陽極附近上樣，未知樣品需檢查在何處上樣，結(jié)果更好;樣品濃度不能過高（zui大 10mg/ml），以避免在上樣位置生成蛋白沉淀。如果懷疑，用裂解緩沖液稀釋，增大上樣體積 樣品溶液中不能含高濃度的鹽。脫鹽或用裂解緩沖液稀釋，低電壓使樣品慢慢進(jìn)入膠中
② 水化時加入樣品 樣品溶液體積需根據(jù) IPG膠條大小調(diào)整（18cm長 IPG膠條約需 400μl樣品溶液），以保證水化后沒有多余的樣品留在水化盤中。檢查高分子量蛋白、堿性蛋白或膜蛋白是否進(jìn)入 IPG膠中
③ 等電聚焦 使用 IPG 膠條時，不要進(jìn)行預(yù)聚焦，否則會因為膠的電導(dǎo)非常低導(dǎo)致樣品很難進(jìn)入膠條;為使樣品進(jìn)入膠的效率增加，采用 30V 低電壓水化;繼續(xù)以低電壓梯度（200V，500V，1000V 各 1 小時）進(jìn)行電泳，zui后達(dá)到 8000V 的進(jìn)行電泳;聚焦時間跟 IPG 膠條的長度、pH 范圍有關(guān)。短的 IPG膠條或?qū)?/span> pH 梯度范圍 IPG 膠條，聚焦時間短 IEF 結(jié)束后，如果 IPG 膠條暫時不進(jìn)行第二向電泳，可于-78℃ 冷凍保存;上樣附近有水析出是因為樣品鹽濃度過高，可脫鹽或稀釋樣品，低電壓上樣，延長樣品進(jìn)入膠的時間
6. IPG 膠條平衡和第二相（SDS-PAGE）
①平衡時間應(yīng)該充分長（至少 2 x 10 分鐘） ②平衡緩沖液包括 Tris-HCl（pH8.8）,SDS（1%）,高濃度尿素（6M）和甘油（30%）提高蛋白質(zhì)的溶解度并減少電內(nèi)滲。*步加入 DTT（1%）是為了使蛋白去折疊;第二步加入碘乙酰胺是為了去除多余的 DTT（銀染過程中，DTT 會導(dǎo)致點拖尾）③對于非常疏水的蛋白或含有二硫鍵的蛋白，相對于 DTT 和碘乙酰胺，tributylphosphine 更有效 ④水平的 SDS-PAGE：濃縮膠中加入大量的甘油（37%）是為了減少電內(nèi)滲⑤水平的 SDS-PAGE：濃縮膠的長度至少超過 25mm ⑥ 蛋白從一向（IPG 膠條）到二向（SDS 膠）的轉(zhuǎn)移為避免點拖尾和損失高分子量蛋白，應(yīng)緩慢進(jìn)行（場強<10V/cm）
SDS 膠垂直拖尾的可能原因解決辦法水平 SDS-PAGE：濃縮膠長度太短有效的濃縮膠長度>25mm蛋白沒有被 SDS 充分包裹平衡緩沖液 SDS 濃度>1%，平衡 2 x 15分鐘糖蛋白用硼酸緩沖液代替 Tris 緩沖液用寬范圍小孔梯度膠蛋白去糖基化部分自由的巰基再次氧化生成二硫鍵聚合物衡緩沖液中加入充足的 DTT，使蛋白烷基化用 tributylphosphine 代替DTT和碘乙酰胺蛋白發(fā)生氨甲?；心蛩氐娜芤杭訜釡囟炔荒艹^ 37℃使用前，尿素去離子化（deionize urea）樣品制備時，內(nèi)源的蛋白酶沒有被抑制TCA-丙酮處理使蛋白酶失活加 SDS 或蛋白酶抑制劑一起煮沸GelBond PAG膜使用前沒有清洗使用前，用去離子水洗 6 x 10 分鐘灰塵或多余的 DTT過濾所有的緩沖液 第二步平衡緩沖液中加入碘乙酰胺去除多余的 DTT雙向電泳圖譜部分變形的可能原因解決辦法IPG 膠條中 NP-40 或 Triton X-100濃度過高如果可能減少 NP-40/Triton的量用 CHAPS 代替 NP-40/Triton蛋白從一向到二向轉(zhuǎn)移完成后，IPG膠條沒有從水平的 SDS 膠上取走第二向采用水平 SDS-PAGE 時,蛋白從一向到二向轉(zhuǎn)移完成后，取走 IPG 膠條緩沖液條沒有覆蓋 SDS 膠上原IPG 膠條結(jié)合的位置第二向采用水平 SDS-PAGE 時，取走 IPG膠條后，將緩沖液條前移，恰好覆蓋 IPG膠條與 SDS 膠結(jié)合位置的前沿溴酚藍(lán)遷移前沿不平的可能原因解決辦法水平 SDS-PAGE ： 冷卻板和GelBong PAG膜之間有氣泡去除氣泡水平 SDS-PAGE：緩沖液條和膠面結(jié)合不好輕壓緩沖液條，使其與膠面充分結(jié)合SDS 小孔梯度膠灌膠和聚合時不水平采用水平臺灌膠