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士鋒生物蛋白質(zhì)純化經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
最近更新時(shí)間：2013-9-6
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
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1）我現(xiàn)在手頭有個(gè)融合蛋白，純化的時(shí)候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細(xì)胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強(qiáng)溶解部分，目的蛋白疏水性比較強(qiáng)。
既然是疏水性很強(qiáng)你可以加點(diǎn)甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時(shí)保護(hù)你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監(jiān)測一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點(diǎn)，這也是個(gè)辦法。
2）請問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?
現(xiàn)在一般要自己合成親和填料，有很多公司都提供活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以，其中比較常用的有溴化氰瓊脂糖凝膠，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好，此外也曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)固定輔酶時(shí)，偶聯(lián)位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對偶聯(lián)的配基有不同的要求，所以要對自己的配基了解比較清楚就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
我一般在合成的時(shí)候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應(yīng)用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質(zhì)剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應(yīng)基團(tuán)。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定，配基脫落少。我覺得是不錯(cuò)的選擇。
包涵體的蛋白復(fù)性做得不多,但是我記得有個(gè)哥們說zui管用的辦法也是zui簡單的方法,他說在復(fù)性的時(shí)候盡量別想什么太高難的技術(shù),那些時(shí)髦但不一定好用,常用的有透析復(fù)性,稀釋復(fù)性,包括國外的專家也這么說.我覺得有時(shí)候開始摸不出來未必就是方法不行,關(guān)鍵要經(jīng)常改變條件.
層析復(fù)性很時(shí)髦,但是真正能用的不很多,我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同,所以關(guān)鍵要多看文獻(xiàn),多琢磨自己蛋白的特性,多嘗試。
3）Sephadex G-25（medium）柱脫鹽時(shí)，鹽濃度太高對柱效有影響嗎?若有，一般對鹽濃度限度如何?
大家別客氣，除鹽對于濃度應(yīng)該也是有一定的限制的，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對需要的柱子的分辨率也要高點(diǎn)，但是在正常的范圍如1-2M應(yīng)該影響不大，不過要除得很干凈還是盡量少上點(diǎn)樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
4）我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化，
現(xiàn)在我用聚乙二醇修飾它 ，分子量增加5000左右，修飾率不可能達(dá)到100%，請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開?（當(dāng)然修飾后還殘留有聚乙二醇，這個(gè)小分子也要除掉）
他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯(cuò)的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應(yīng)該是不錯(cuò)的選擇。此外PEG是個(gè)疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強(qiáng)，修飾度越高，疏水性越強(qiáng)，可以用這個(gè)原理分離。離子交換也可以選擇，因?yàn)橥瑯拥览?，修飾度越高，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此?yīng)該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開，你在這幾個(gè)方法里選擇看哪個(gè)更經(jīng)濟(jì)好用就可以。
5）我是個(gè)新手，謝謝樓主給我解決了許多難題。
我有個(gè)問題困繞很久，從細(xì)菌中提取酶，好象用常規(guī)的方法（超聲波破壁，緩沖液提?。?，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏歲水性較強(qiáng)，需要加助溶劑才能提取出來?另外，我是不是也可以加點(diǎn)甘油或者PEG來提取?
其實(shí)這個(gè)問題我覺得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標(biāo)蛋白的分子量你是應(yīng)該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問題你再解決如何提取。
對于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經(jīng)提取一個(gè)酶用水就是提取不出來，需要用鹽才能提取出來，多試試，設(shè)計(jì)個(gè)方案，這樣才能解決問題，所以不一定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會不會有問題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續(xù)探討。
6）HPLC是用來分析檢測or分離純化?
如果可以用來純化，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來分析檢測，怎樣指導(dǎo)以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì)，同時(shí)配合質(zhì)譜等就何以得到很多單一蛋白的特性包括序列等，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好,定量準(zhǔn)確,所以也可以用于定量和定性,是分析中*的工具.
分析出來后如果這個(gè)物質(zhì)很穩(wěn)定，直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應(yīng)有了制備的條件。