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士鋒生物關(guān)于bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法討論
最近更新時(shí)間：2013-9-11
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
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1、選擇應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)蛋白質(zhì)量，做BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟時(shí)已經(jīng)測(cè)得梯度蛋白量的吸光值。想求助：在excel中怎樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Q1、很簡(jiǎn)單的，將蛋白質(zhì)濃度放在一列，相應(yīng)的吸光度放在一列，將兩列選中后，選擇插入圖形，選散點(diǎn)圖，然后在插入的圖形上的點(diǎn)右擊選擇添加趨勢(shì)線，并勾選顯示公式和R值，即可得到方程式。
Q2、用梯度蛋白量和吸光值先做出散點(diǎn)圖，然后點(diǎn)擊選中直線，在直線處點(diǎn)擊鼠標(biāo)左鍵，出現(xiàn)“添加趨勢(shì)線”，點(diǎn)擊進(jìn)入，在“類型”菜單中選擇“線性”，在“選項(xiàng)”菜單中選擇“顯示公式”“顯示R2值”，點(diǎn)擊“確定”，圖中即出現(xiàn)線性方程和R2，此方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
2、如何測(cè)BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線?配置BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，需要濃度到小數(shù)點(diǎn)后四位嗎?
一般3個(gè)9以上就可以了，我們實(shí)驗(yàn)室一般認(rèn)為99.98%就足夠。
可以的，要注意幾點(diǎn)，一個(gè)是配置高濃度原液，而后在其基礎(chǔ)上稀釋；二是充分震蕩，每個(gè)步驟都要充分震蕩；三要選擇比較好的蛋白測(cè)定試劑盒，能用進(jìn)口的就不要用國(guó)產(chǎn)的!
3、為什么BSA可以用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線而不是選其他蛋白?
Q1、分子量68KD。BSA用的多主要是便宜，其他一些純蛋白是非常貴的，差價(jià)幾萬(wàn)倍都是可能的。
4、BSA是否每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線都要重配?
Q1、不用，你可以一批配100ml，然后分裝成小管凍存起來(lái)，以后每次用的時(shí)候取一只，這樣可以避免多次配置所產(chǎn)生的差異，使用也方便
Q2、書(shū)上寫(xiě)一般情況下都是要做標(biāo)曲的,但是不做的話差別也不是太大,但是要的話還是得做標(biāo)曲.
5、我用考馬斯亮藍(lán)染色的方法作BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線，怎么也做不出來(lái)!4mg/ml,5mg/ml,6mg/ml,7mg/ml,8mg/ml,10mg/ml的 bsa在595nm下的吸光值沒(méi)有明顯的區(qū)別，還出現(xiàn)濃度越大，吸光值越小的現(xiàn)象，真是令我哭笑不得，請(qǐng)高手指點(diǎn)，謝謝!
Q1、1,看看你的考馬斯亮藍(lán)是否配的有問(wèn)題，注意配好后必須用慢速濾紙過(guò)濾，保證濾液中沒(méi)有藍(lán)色沉淀（會(huì)影響OD595）。
2，你的BSA濃度太高了，測(cè)定是OD595會(huì)很大。在測(cè)定光吸收時(shí)，測(cè)量值的準(zhǔn)確度數(shù)范圍是：0.1-0.3。讀數(shù)大于0.5時(shí)就不準(zhǔn)了。
3，BSA要現(xiàn)用現(xiàn)配，不可久放。
以下測(cè)量方法僅供參考：
取21支試管做三組平行（每組7支）：
向7支試管中依次加入：
（1）考馬斯亮藍(lán)各5ml；
（2）分別加入0.15mol的NaCl 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04ml；
（3）分別加入1.0mg/ml的新配的BSA 0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06ml；
混勻后，在595nm處測(cè)光吸收，讀數(shù)大部分在0.1-0.3之間。
注意在加入BSA 5-20min內(nèi)測(cè)完，此時(shí)間內(nèi)顏色zui穩(wěn)定。
然后三組求平均，用蛋白含量對(duì)OD595作圖，線性擬合后，一般得到直線的R>0.99,嚴(yán)格要求應(yīng)使R>0.999.
在測(cè)量蛋白濃度時(shí)，可先將其稀釋為0.5-2mg/ml 左右，加入0.02-0.08ml；即可得到一個(gè)較好的讀數(shù)（一般在0.1-0.3之間）。
Q2、你的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍有問(wèn)題,BSA濃度從0.1~1mg范圍內(nèi)選擇,那樣的濃度都是超出量程的,測(cè)了也沒(méi)用.還有,機(jī)器的量程是多少你沒(méi)說(shuō),吸光值在0.1~1范圍內(nèi)還是比較準(zhǔn)確的,這還是進(jìn)口設(shè)備,國(guó)產(chǎn)的量程有效范圍更窄.自己重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)吧