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士鋒生物葡聚糖凝膠柱層析純化PPO粗酶液
最近更新時(shí)間：2013-9-12
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
文件類(lèi)型：JPG 圖片下載次數(shù)：133次
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一、原理
1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部zui先流出柱外，而小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流速慢而zui后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開(kāi)。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì)）
2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因?yàn)镻PO是帶有陽(yáng)離子的蛋白質(zhì)，在層析時(shí)會(huì)吸附在柱材料上，而雜蛋白會(huì)洗下。后用NaCl梯度洗脫P(yáng)PO，（NaCl為強(qiáng)離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來(lái)）。粗酶液從而得到純化。
二、材料與試劑
試劑：0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）配制時(shí)配×10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇;DEAE-纖維素DE52;葡聚糖凝膠SephadexG-200;蘭葡萄糖-40、70、100等;
實(shí)驗(yàn)器械與儀器設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等;試劑瓶、層析柱、pH計(jì)和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監(jiān)測(cè)儀、GL-20C高速冷凍離心機(jī)、DL-7A大容量低速冷凍離心機(jī)
三、操作步驟
1.葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡
（1）柱材處理
稱(chēng)取一定量的SephadexG-200干粉，加無(wú)離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細(xì)微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進(jìn)抽濾瓶中，進(jìn)行抽真空處理，直到凝膠液中沒(méi)有氣泡出現(xiàn)為止。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無(wú)離子水，打開(kāi)下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生氣泡，影響蛋白質(zhì)分離速度，濃度過(guò)低易產(chǎn)生凝膠分層，影響蛋白質(zhì)的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內(nèi)徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過(guò)程的緩沖液（洗脫液）置換出來(lái)，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過(guò)程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開(kāi)層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4（內(nèi)含0.0001MEDTA），平衡SephadexG-200凝膠。
2.上樣：將粗酶液上柱。
3.洗脫：用0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）洗脫，收集洗脫液進(jìn)行酶活性、蛋白質(zhì)濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質(zhì)分析測(cè)定。
4.DEAE-纖維素的處理及裝柱
（1）處理
本實(shí)驗(yàn)采用的是DEAE-纖維素DE52是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì);再在0.5N的HCL溶液中浸泡1-2h,再用無(wú)離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干;將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1-2h，再用無(wú)離子水或蒸餾水將其洗至中性。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無(wú)離子水，打開(kāi)下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過(guò)程的緩沖液（洗脫液）置換出來(lái)，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過(guò)程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開(kāi)層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4（內(nèi)含0.0001MEDTA），預(yù)先將DE-52柱進(jìn)行平衡。
5.上樣：
將洗脫酶液上樣，用0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）洗脫雜蛋白。
6.洗脫：
用含NaCL（0.2-0.6M）的0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）進(jìn)行梯度洗脫。
7.測(cè)定酶活性和蛋白質(zhì)濃度。