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士鋒生物質(zhì)譜的實驗詳細(xì)介紹
最近更新時間：2013-9-18
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>37KB
文件類型：JPG 圖片下載次數(shù)：667次
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試劑耗材：
Milli-Q water、Non-powder gloves、Face mask、Hat、10μl and 200μl tips（eppendorf）、Menthol（Fisher M/4056/17）、Acetonitrile（Fisher A/0626/17）、Trypsin （Promega V528）、Trypsin resolve solution（Promega V530）、Ammonium bicarbonate（Sigma A6141）、ZipTip μC-18（Millipore ZTC18M096）、TFA（GE healthcare）、0.2ml and 0.5ml EP tube（eppendorf）、50ml EP 0.5ml EP（Corning）
用具儀器：
真空干燥儀、水浴鍋、10μ和200μ移液器、廢液缸、制冰和裝冰設(shè)備、200μ管架、剪刀、能裝放置了200μ管管架的塑料盒、200μ管離心機(jī)。
準(zhǔn)備：
1. 0.2ml EP管三套，MillIQ水和甲醇各涮一遍，真空干燥。
2. 50ml EP管六支，MilliQ水和甲醇各涮一遍，真空干燥。
3. 胰酶儲液制備：使胰酶粉末沉落瓶底，用100μ胰酶重旋液溶解，用0.5ml EP分裝成5μl。
4. 50ml 100 mM NH4HCO3。
脫色酶切：
1. 切點將200μl tip頭剪成吸口1.5mm左右的直徑，MilliQ水涮洗一遍，吸100μl水后戳取斑點，將膠粒打入0.2ml EP管中，吸干水后再用MilliQ水洗滌兩遍，吸干。
2. 脫色 180μl 50%MeOH/50mM NNH4HCO3脫色兩次以上，每次半小時;180μl MilliQ水洗滌5分鐘，180μ 50% ACN洗滌5分鐘，180μl 100%ACN洗滌5分鐘;真空干燥半小時。
3. 酶切
① 25 mM NH4HCO3稀釋胰酶至12.5μg/μl;每管膠粒加入胰酶3μl，冰浴15分鐘后洗掉多余的胰酶;再加入3μl左右25 mM NH4HCO3至覆蓋膠粒。
② 小心將EP管倒轉(zhuǎn)，將整個EP管架放入塑料盒中后放入37度水浴鍋酶切16小時。
③ 將塑料盒從37度水中撈出，注意不要倒掉水，冷卻至室溫。
④ 加入10μl 25 mM NH4HCO3，震蕩15分鐘，離心后收集至新管;
加入10μl 2.5%TFA，震蕩5分鐘，收集至上管;
加入10μl 2.5%TFA-50% ACN，震蕩5分鐘，收集至上管;
加入10μl 100% ACN，震蕩5分鐘，收集至上管。
⑤ 將此收集液真空濃縮至5-10μl后，加入20μl 0.5%TFA;繼續(xù)濃縮至10-20μl。
肽段濃縮除鹽：
1. 吸10μl 100% ACN，棄之，重復(fù)兩次;
2. 吸10μl 0.1% TFA，棄之，重復(fù)兩次;
3. 吹吸樣本15次;
4. 吸10μl 0.1% TFA，棄之，重復(fù)兩次;
5. 吸3μl 0.1% TFA-50% ACN，將此洗脫液轉(zhuǎn)入新EP管。
質(zhì)譜種類
質(zhì)譜儀種類非常多，工作原理和應(yīng)用范圍也有很大的不同。從應(yīng)用角度，質(zhì)譜儀可以分為下面幾類：
有機(jī)質(zhì)譜儀：由于應(yīng)用特點不同又分為：
① 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）在這類儀器中，由于質(zhì)譜儀工作原理不同，又有氣相色譜-四極質(zhì)譜儀，氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，氣相色譜-離子阱質(zhì)譜儀等。
② 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）同樣，有液相色譜-四器極質(zhì)譜儀，液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀，液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，以及各種各樣的液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。
③ 其他有機(jī)質(zhì)譜儀，主要有：基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOFMS），富立葉變換質(zhì)譜儀（FT-MS）
無機(jī)質(zhì)譜儀，包括：
① 火花源雙聚焦質(zhì)譜儀。
② 感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）。
③ 二次離子質(zhì)譜儀（SIMS）
但以上的分類并不十分嚴(yán)謹(jǐn)。因為有些儀器帶有不同附件，具有不同功能。例如，一臺氣相色譜-雙聚焦質(zhì)譜儀，如果改用快原子轟擊電離源，就不再是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，而稱為快原子轟擊質(zhì)譜儀（FAB MS）。另外，有的質(zhì)譜儀既可以和氣相色譜相連，又可以和液相色譜相連，因此也不好歸于某一類。在以上各類質(zhì)譜儀中，數(shù)量zui多，用途zui廣的是有機(jī)質(zhì)譜儀。
除上述分類外，還可以從質(zhì)譜儀所用的質(zhì)量分析器的不同，把質(zhì)譜儀分為雙聚焦質(zhì)譜儀、四極桿質(zhì)譜儀、飛行時間質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀、傅立葉變換質(zhì)譜儀等。
質(zhì)譜儀的選擇竅門
質(zhì)譜儀種類繁多，不同儀器應(yīng)用特點也不同,一般來說，在300C左右能汽化的樣品，可以優(yōu)先考慮用GC-MS進(jìn)行分析，因為GC-MS使用EI源，得到的質(zhì)譜信息多，可以進(jìn)行庫檢索。毛細(xì)管柱的分離效果也好。如果在300℃左右不能汽化，則需要用LC-MS分析，此時主要得分子量信息，如果是串聯(lián)質(zhì)譜，還可以得一些結(jié)構(gòu)信息。如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要得分子量信息。對于蛋白質(zhì)樣品，還可以測定氨基酸序列。質(zhì)譜儀的分辨率是一項重要技術(shù)指標(biāo)，高分辨質(zhì)譜儀可以提供化合物組成式，這對于結(jié)構(gòu)測定是非常重要的。雙聚焦質(zhì)譜儀，傅立葉變換質(zhì)譜儀，帶反射器的飛行時間質(zhì)譜儀等都具有高分辨功能。
質(zhì)譜分析法中的樣品選擇
質(zhì)譜分析法對樣品有一定的要求。進(jìn)行GC-MS分析的樣品應(yīng)是有機(jī)溶液，水溶液中的有機(jī)物一般不能測定，須進(jìn)行萃取分離變?yōu)橛袡C(jī)溶液，或采用頂空進(jìn)樣技術(shù)。有些化合物極性太強(qiáng)，在加熱過程中易分解，例如有機(jī)酸類化合物，此時可以進(jìn)行酯化處理，將酸變?yōu)轷ピ龠M(jìn)行GC-MS分析，由分析結(jié)果可以推測酸的結(jié)構(gòu)。如果樣品不能汽化也不能酯化，那就只能進(jìn)行LC-MS分析了。進(jìn)行LC-MS分析的樣品是水溶液或甲醇溶液，LC流動相中不應(yīng)含不揮發(fā)鹽。對于極性樣品,一般采用ESI源，對于非極性樣品，采用APCI源。