士鋒生物血清免疫球蛋白的提取分離、純化及鑒定

最近更新時(shí)間：2013-9-27

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相關(guān)產(chǎn)品：

I 血液及組織樣品的制備

分析組織中某種物質(zhì)的含量、探索物質(zhì)代謝的過(guò)程和規(guī)律，經(jīng)常使用動(dòng)物的肝、腎、腦、粘膜和肌肉等組織，也選用全血、血漿、血清或者無(wú)蛋白血濾液等血液樣品，有時(shí)也采用尿液、胃液等完成各種生化實(shí)驗(yàn)。掌握以上各種實(shí)驗(yàn)樣品的正確處理和制備方法是保證生化實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。
一、血液樣品
（一）采血
測(cè)定用的血液，多由靜脈采集。一般在飼喂前空腹采取，因此時(shí)血液中化學(xué)成分含量比較穩(wěn)定，采血時(shí)所用的針頭、注射器，盛血容器要清潔干凈；接血時(shí)應(yīng)讓血液沿著容器壁慢慢注入，以防溶血和產(chǎn)生泡沫。
（二）血清、全血及血漿的制備
1.血清的制備
血清是全血不加抗凝劑自然凝固后析出的淡黃清亮液體。制備方法是：將剛采集的血液直接注入試管或離心管中。將試管放成斜面，讓其自然凝固，一般經(jīng)3h 血塊自然收縮而析出血清；也可將血樣放入37 ℃ 恒溫箱內(nèi)，促使血塊收縮，能較快約析出血清。為了縮短時(shí)間，也可用離心機(jī)分離（未凝或凝固的均可離心），分離出的血青，用吸管吸出置于另一試管中，若不清亮或帶有血細(xì)胞，應(yīng)重離心，加蓋冷藏備用。
2.全血及血漿的制備
取清潔干燥的試管或其它容器，收集動(dòng)物的新鮮血液，立即與適量的抗凝劑充分混合，所得到的抗凝血為全血。每毫升血液中加入抗凝劑的種類可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行選擇，但是用量不宜過(guò)大，否則將影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將已抗凝的全二于2，000r / min 離心10min ，沉降血細(xì)胞，取上層清液即為血漿。血漿比血清分離得快而且量多：兩者的差別，主要是血漿比血清多含一種纖維蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝劑
凡能夠抑制血液凝固反應(yīng)進(jìn)行的化合物稱為抗凝劑?？鼓齽┓N類甚多，實(shí)驗(yàn)室常用的有如下幾種，可根據(jù)情況選擇使用。
（1）草酸鉀（鈉） 優(yōu)點(diǎn)是溶解度大，可迅速與血中鈣離子結(jié)合，形成不溶性草酸鈣，使血液不凝固。每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸鉀水溶液二吸取此液0.1ml 放入一試管中，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)試管，泛草酸鉀盡量鋪散在試管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干（若超過(guò)150 ℃ 則分解），管壁即呈一薄層三色粉末，加塞備用?？煽鼓?ml 。
此抗凝血，常用于非蛋白氮等多種測(cè)定項(xiàng)目，但不適用于鉀、鈣的測(cè)定。對(duì)乳酸脫氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用時(shí)應(yīng)注意。
（ 2）草酸鉀-氟化鈉氟化鈉 是一種弱抗凝劑。但濃度2mg / ml 時(shí)能抑制血液內(nèi)葡萄糖的分解，因此在測(cè)定血糖時(shí)常與草酸鉀混合使用。
配制方法：草酸鉀6g、氟化鈉3g，溶于100ml 蒸餾水中。每個(gè)試管加入0.25ml，于80℃ 烘干備用。每管含混合劑22. 5mg，可抗凝5ml 血液。
此抗凝血，因氟化鈉抑制睬酶，所以不能用于脈酶法的尿素氮測(cè)定；也不能用于淀粉酶及磷酸酶的測(cè)定。
（3）乙二胺四乙酸二鈉鹽（簡(jiǎn)稱EDTANa2 ） EDTANa2 易與鈣離子絡(luò)合而使血液不凝。
有效濃度為0.5mg 可抗凝lml 血液。
配制方法：配成4 % EDTANa ：水溶液。每管裝0.lml , 80 ℃ 烘干，可抗凝5ml 血液。此抗凝血液適用于多種生化分析。但不能用于血漿中含氮物質(zhì)、鈣及鈉的測(cè)定。
（4）肝素 *抗凝劑，主要抑制凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而凝血：0.1 -0.2mg 或20 單位可抗凝lml 血液。
配制方法：配成10mg /ml 的水溶液。每管加0.lml 于37-56 ℃ 烘干，可抗凝5-10ml血液（市售品為肝素鈉溶液，每毫升含12,500 單位，相當(dāng)干100mg ，故每125 單位相當(dāng)于lmg ）
除上述抗凝劑外，還有檸檬酸鈉、草酸銨等，因不常用，故不作介紹。
（三）無(wú)蛋白血濾液的制備
測(cè)定血液或其它體液化學(xué)成分時(shí)，樣品內(nèi)蛋白質(zhì)的存在常常干擾測(cè)定。因此，需要先做成無(wú)蛋白血濾液再行測(cè)定。
無(wú)蛋白血濾液制備的基本原理是以蛋白質(zhì)沉淀劑沉淀蛋白，用過(guò)濾法或離心法除去沉淀的蛋白。現(xiàn)介紹幾種常用的方法：
1.鎢酸法
原理： 鎢酸鈉與硫酸混合，生成鎢酸：
Na2WO4 + H2SO4 → H2WO4 十Na2SO4
血液中蛋白質(zhì)在pH 值小于等電點(diǎn)的溶液中可被鎢酸沉淀：沉淀液過(guò)濾或離心，上清液即為無(wú)色而透明、pH 約等于6 的無(wú)蛋白濾液?？晒┓堑鞍椎⒀?、氨基酸、尿素、尿酸及氯化物等項(xiàng)測(cè)定使用。
制備方法：
（1）取50ml 錐形瓶1 只，加入蒸餾水7 份；（2）用奧氏吸管吸取抗凝血1 份，擦去管壁外血液，將吸管插入錐形瓶底部，緩緩放出血液。放完血液后，將吸管提高吸取上清液再吹入，反復(fù)洗管3 次。充分混合，使紅細(xì)胞*溶解；（ 3）加入0.333mol/l，硫酸溶液1 份，隨加隨搖，充分混勻，此時(shí)血液由鮮紅變成棕色，靜置5-10min ，使其酸化*；（4） 加入10 ％鎢酸鈉1 份，隨加隨搖；（5）放置約5min 后，如振搖亦不再發(fā)生泡沫，說(shuō)明蛋白質(zhì)已*變性沉淀。用定量濾紙過(guò)濾或離心（2,500r/min , 10min） ，即得*澄清無(wú)色之無(wú)蛋白血濾液。
用此法制得的無(wú)蛋白血濾液為10 倍稀釋的血濾液。即每毫升血濾液相當(dāng)于0.lml全血。
試劑：（1） 10 ％鎢酸鈉溶液（2） 0.333mol/L 硫酸溶液
2.氫氧化鋅法
原理：血液中蛋白質(zhì)在pH 大于等電點(diǎn)的溶液中可用znZ 十來(lái)沉淀。生成的氫氧化鋅本身為膠體可將血中葡萄糖以外的許多還原性物質(zhì)吸附而沉淀，所以此法所得濾液zui適作血液葡萄糖的測(cè)定（因?yàn)槠咸烟嵌嗍抢盟倪€原性來(lái)定量的）。但測(cè)定尿酸和非蛋白氮時(shí)含量降低，不宜使用此濾液。
制備方法：（1）取干燥、潔凈的50ml 錐形瓶或大試管1 支，準(zhǔn)確加入7 份水；（2）加入混勻的抗凝血1 份，搖勻；（3）加入10 ％硫酸鋅溶液1 份，搖勻；（4）慢慢加入0.5mol / L 氫氧化鈉溶液1 份，邊加邊搖，放置5min ，用定量濾紙過(guò)濾或離心（2,500，10min ） ，除去沉淀，便得到*澄清的無(wú)蛋白血濾液。此濾液亦為稀釋10 倍之血濾液。
試劑：（l） 10 ％硫酸鋅溶液（2） 0.5mol / L 氫氧化鈉溶液
3.三氯醋酸法
原理：三氯醋酸為一有機(jī)強(qiáng)酸，能使蛋白質(zhì)變性而沉淀。
制備方法：取10 ％三氯醋酸9 份置于錐形瓶或大試管中，加1 份已充分混勻的抗凝血液。加時(shí)要不斷搖動(dòng)，使其均勻。靜置5min ，過(guò)濾或離心。即得10 倍稀釋之清明透亮的濾液。
 

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