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士鋒生物蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)
最近更新時間：2013-9-29
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一、目的：
1、了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式
2、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理
3、學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法
二、呈色反應(yīng)
（一）雙縮脲反應(yīng)：
1、原理：尿素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境下能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)（一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽）?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。
2、材料與試劑：尿素 10g;10%的氫氧化鈉溶液 250ml;1%硫酸銅溶液 60ml;2%卵清蛋白溶液（或雞蛋清溶液蛋清：水=1:9）
3、操作：
（1）取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素溶化。溶化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。
（2）冷卻后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴。觀察顏色的變化。（注意避免硫酸銅過量）
（3）向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液約2ml,搖勻，再加1滴1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察顏色的變化。
（二）茚三酮反應(yīng)
1、原理：所有的a-氨基酸（除脯氨酸、羥脯氨酸外）都能與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。整個反應(yīng)分兩步，*步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮;第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜條件為5——7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同PH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。
2、材料與試劑：蛋白質(zhì)溶液：2%的卵清蛋白或新鮮雞蛋蛋清溶液（蛋清：水=1：9） 100ml;0.5%甘氨酸溶液 80ml;0.1%茚三酮溶液 50ml;0.1%茚三酮-乙醇溶液 20ml。
3、操作：
（1）取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液合甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%的茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1-2分鐘，觀察顏色由粉色變紅色再變藍(lán)。
（2）在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。
（三）黃色反應(yīng)
1、原理：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。
2、材料與試劑：雞蛋清溶液（100ml）：將新鮮雞蛋的蛋清與水按1：20混勻，然后用6層紗布過濾;大豆提取液（100ml）：將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀再用紗布過濾;頭發(fā);指甲;0.5%苯酚溶液 50ml;濃硝酸 200ml;0.3%色氨酸溶液 10ml;0.3%酪氨酸 10ml;10%氫氧化鈉溶液 100ml
3操作：
向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各試管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫逐滴加入10%氫氧化鈉至堿性，觀察顏色變化。
管號 1 2 3 4 5 6 7
材料
（滴） 雞蛋清溶液
4 大豆提取液
4 指甲
少許 頭發(fā)
少許 0.5％苯酚
4 0.3％色氨酸
4 0.3％酪氨酸
濃硝酸（滴） 2 4 40 40 4 4 4
現(xiàn)象
（四）考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)
1、原理：考馬斯亮藍(lán)G250具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色;當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。特點(diǎn)：染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時間達(dá)到平衡，在室溫一小時內(nèi)穩(wěn)定。在0.01-1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量。
2、試劑：蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清：水=1：20）;考馬斯亮藍(lán)染液（考馬斯亮藍(lán)G250100g溶于50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸混勻，配成原液。臨用前取原液15ml，加蒸餾水至100ml,用粗濾紙過濾后，zui終濃度為0.01%。
3、操作：取2支試管，按下表操作
管號試劑 蛋白質(zhì)溶液（ml） 蒸餾水（ml） 考馬斯亮藍(lán)
1 0 1 5
2 0.1 0.9 5