士鋒生物Western Blot的實(shí)驗(yàn)分析

最近更新時(shí)間：2013-10-10

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相關(guān)產(chǎn)品：

  蛋白提取：

1. 總蛋白提取（胞膜，胞漿，胞核）：

組織勻漿后,15000g, 4度, 20分鐘后,取上清.

Buffer:NP40 750ul, 脫氧膽酸鈉0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF（7.4mg/ml） 0.1ml. （現(xiàn)用現(xiàn)加）

7.4mg/ml PMSP異丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 異丙醇.工廠-20度儲(chǔ)存

2.組織膜蛋白提?。核诓僮鞅线M(jìn)行

（1）取組織，用PBS沖洗干凈組織上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀盡可能剪碎組織,于冰上充分勻漿。每次30秒,重復(fù)3-5次.

（2）離心機(jī) 1000rpm，4℃ 離心 10min 后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。（去掉大塊組織及結(jié)締組織）

（3）100000g，4℃ 離心 1hr, 棄去上清.（此為胞漿蛋白,若只提取胞漿蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分鐘離心，取上清即可 ）。沉淀用適量的 Buffer B重懸，4度過后，分裝至 EP管，eppendorf 臺(tái)式離心機(jī)10000rpm，4℃ 離心 30min。

（4）收集所得上清液即為膜組份。

Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。

Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。

所得蛋白分裝EP管（每管約50ul），取一管測蛋白濃度，其它放入-70度深凍冰箱保存。

如果要定量的話，能立即根據(jù)濃度，加入上樣緩沖，煮沸，4度保存。反復(fù)凍融蛋白會(huì)降解，濃度不準(zhǔn)。

考馬斯亮蘭G250測蛋白濃度：

考馬斯亮蘭G250配方：G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至2000ml,過濾后使用。

BSA標(biāo)準(zhǔn)液：0.5mg/ml BSA, 雙蒸水配制。

配制標(biāo)準(zhǔn)液（濃度分別為0，10，20，30，40，50ug/ul）：

1 2 3 4 53 6

G250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml

0.5mg/ml

BSA ------ 20ul 40ul 60ul 80ul 100ul

ddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul -----

待測蛋白配液：每管3ml G250，2ul樣品，98ul ddH2O。（若加入樣品后，液體沒有變藍(lán)色，則可再加2ul樣品，ddH2O減為96 ul，標(biāo)準(zhǔn)液濃度可適當(dāng)擴(kuò)大。）

紫外分光光度計(jì)，595nm，用1號(hào)管調(diào)零，制出標(biāo)準(zhǔn)曲線, 標(biāo)準(zhǔn)方程及R值（R值應(yīng)大于0.99, 否則操作誤差較大）,測量待測蛋白OD值，算出蛋白濃度。（若加入2ul樣品，則濃度值需除2，方為真正濃度; 若加4ul樣品，則除4）

聚丙烯酰胺電泳：

1.自來水，洗滌劑清洗玻璃板，用ddH2O沖洗干凈，立放于盒子內(nèi)，60度烤箱烘干備用。

2.配膠：

凝膠儲(chǔ)備液（30% Acr/Bise）：

丙烯酰胺29克，雙體甲叉雙丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有說要棕色瓶保存，3個(gè)月?lián)Q新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，棄掉）

10%APS：0.1克過硫酸銨，加 ddH2O至1 ml.（4度保存,一周內(nèi)使用），本人都是配新鮮的用。

10%SDS: 1克SDS,10 ml ddH2O. （不溶時(shí),可加熱50度左右助溶.）

TEMED: 原液即可.

0.5M Tris-HCl （PH6.8）;

1.5M Tris-HCl （PH8.8）: 9.0855克Tris, 加入ddH2O溶解后,用HCL調(diào)PH至8.8,加ddH2O到50ML

配膠的濃度和方法書上都有，不詳細(xì)說了!

本人做的是70KD 和17KD 的分子量，分別配了10%和12%的分離膠，4%的濃縮膠。搖動(dòng)溶液充分混合（不要過于劇烈以免引入過多地氧氣）灌入2/3的分離膠后（估計(jì)距梳子底1CM）應(yīng)立即用ddH2O封膠。等到能看清水和膠的分界線，則可配濃縮膠。用面巾紙吸干水后，注入濃縮膠，至頂。插入梳子，不要有氣泡。

藍(lán)色字體是從別人貼子上看到的

這些小孔的孔徑隨 “雙丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而變小，比率接近 1：20 時(shí)孔徑達(dá)到zui小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”為1：29 配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有3% 的蛋白質(zhì)。

分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4℃，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）

PAGE配膠的試劑和配方比例對(duì)電泳結(jié)果的質(zhì)量當(dāng)然有決定性的影響，這個(gè)配膠的比例，在《分子克隆》上有詳細(xì)的論述。容易忽視的問題主要在于過硫酸銨（AP）一定要新鮮——用小指管配AP（寫日期）保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開使用多次的AP都別用。 膠濃度<10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度>10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS），封膠后切記，勿動(dòng)。如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。

等濃縮膠凝的時(shí)間，就可以配蛋白了。按照想要的濃度加入LOADING BUFFER配制。本人按每孔總體積20ul, 終濃度1* RSB，含50ug蛋白混合樣品，不足的體積用1* PBS補(bǔ)足。短暫離心后，沸水中煮5分鐘，放室溫，用時(shí)再短暫離心。

例如. 50ug/20ul，做2.5孔, 即50ul，125ug

1 　　　　　　　2 　　　　　　　　3 　　　　　4

蛋白濃度 10.33 ug/ ul 13.91 ug/ ul 14.87 ug/ ul 19.03 ug/ ul

所需體積 12.1 ul 　　　　　　9 ul 　　　　　　8.4 ul 　　　　　6.6 ul

5*RSB 10 ul 　　　　　　10 ul 　　　　　　10 ul 　　　　　10 ul

1* PBS 27.9 ul 　　　　　　31 ul 　　　　　　31.6 ul　　　　33.4 ul

5*RSB: 1.89克 Tris-HCL（PH 6.8）, 5克 SDS, 0.125克溴酚藍(lán), 25ML 甘油.（很粘稠）

Beta-巰基乙醇用時(shí)現(xiàn)加,按25%比例.

10* PBS: Nacl 4.25克,Na2HPO4. 12H2O 15.4g, NaH2PO4 2H2O 1.4g, 調(diào)PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ml

約30分鐘左右, 取下梳子,將膠板放入電泳槽內(nèi),加入1*電泳緩沖液, 沖洗加樣孔. 微量進(jìn)樣器逐個(gè)加樣,空泳道加入1* RSB. 兩膠板之間的電泳液要滿. 接好正負(fù)極, 開始電泳, 可先小電壓,約50V ,大約跑過濃縮膠后再改為100V. 觀察MARKER的情況, 適時(shí)終止電泳.

建議說目的帶要跑到分離膠的2/3處比較好,但本人一直都在上1/3處,結(jié)果也還可以.

預(yù)染MARKER很重要,開始選了一個(gè)國產(chǎn)的,總是跑不好,后來換成NEB的,效果很好,而且也不貴,范圍也比較廣,把我要的7.,42.17全都包括在內(nèi).

如果濃縮膠跑的好的話, 幾個(gè)孔的蛋白會(huì)跑成一條直線.

注意加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液

未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù).梳子插入濃縮膠時(shí),應(yīng)確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生,梳子拔出來時(shí)應(yīng)該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內(nèi).

10* 電泳緩沖液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.

不好溶,可用攪拌器.

可重復(fù)使用,每次加一些新的進(jìn)去.但本人每次都是配新的,也不麻煩.

轉(zhuǎn)膜：

跑完電泳后,取出膠,可以一塊做考馬思亮藍(lán)R250染色約30分鐘, 脫色液脫色, 看看蛋白條帶跑的如何,上樣量如何.

另一塊可用做轉(zhuǎn)膜. 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中搖30分鐘左右（有次著急只晃了10分鐘，結(jié)果也挺好的）。開始用的PVDF膜, 0.45um, 用國產(chǎn)的MARKER后,總是染的不清楚, 而且無論時(shí)間長短, zui后一塊濾紙都會(huì)被染色. 后來換了NEB后,PVDF也不容易上色（可能和PVDF的質(zhì)量有關(guān),我買的雖然也是MILLIPORE,但好像比較便宜20CM*10CM才50塊錢）. 麗春紅染色也很少能看清條帶,后來發(fā)現(xiàn),染色后用甲醇洗,比較容易看出來,但是很難洗掉紅色，不知道有沒有影響。后來換成NC膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER易染上，麗春紅也易著色，還一洗就掉。能比較清楚的了解轉(zhuǎn)膜效果。

不同轉(zhuǎn)膜儀和電源轉(zhuǎn)膜的條件不同，我用的是BIO-RAD 的半干轉(zhuǎn)（電壓不過25V的那款），電源是BIO-RAD的PC200，70KD的我轉(zhuǎn)50分鐘，20V，17KD的轉(zhuǎn)20V，30分鐘左右，條件不是很穩(wěn)定，有時(shí)半路打開蓋子看看MARKER轉(zhuǎn)的情況，但膜和膠的位置一定不能竄。也有人說用恒流，說1.2-2MA/CM2我看了一下，我的膠大約都是5*3左右大的，20V一般電流會(huì)是60-30MA之間，要是這樣算的話,zui高就30MA, 我不太清楚.

如果用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段時(shí)間，我一般是5分鐘，但也有人說不過30秒，不清楚。換了NC膜就直接放入轉(zhuǎn)移緩沖液中的，晃30分鐘左右。

濾紙開始是買的那種濾紙，上面三張，下面三張，后來有人說這種濾紙是做濕轉(zhuǎn)用的，應(yīng)當(dāng)用那種比較厚的，上下各一張，我也不知道，后來就換成普通濾紙了，上下大約各15張左右，有時(shí)著急還反復(fù)用過，效果也還可以，估計(jì)問題不大。

因?yàn)檫@款半干轉(zhuǎn)膜儀說明書上說不會(huì)短路，所以一般濾紙》膜》膠. 他們之間一定不要有氣泡.。膜上要做好標(biāo)記，識(shí)別正反面和上下,切個(gè)小角是常用的方法, 有MARKER也方便記.

轉(zhuǎn)膜后的膠可用考染看看轉(zhuǎn)膜情況.

考馬斯亮藍(lán)R250: R250 0.25克, 甲醇50ML, 冰乙酸40ML, 加水到100ML.

脫色液: 乙酸 50ML, 甲醇225ML（可用乙醇）, ddH2O500ML

10*麗春紅（20ML）: 2%麗春紅（0.4克）, 30%三乙酸（6克）, 30%磺基水楊酸（6克）. 用時(shí)加入9 倍的ddH2O

10*轉(zhuǎn)膜緩沖液:

70KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, SDS 1.85克, 加水到500ML.

用時(shí)取10ML, 加20ML 甲醇, 加70ML 雙蒸水

17KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, 加水到500ML.

用時(shí)取10ML, 加50ML 甲醇, 加40ML 雙蒸水

封閉：

用5%的封閉液（伊利的高鈣脫脂）, 室溫,搖床1小時(shí).

5%封閉液: 1克脫脂奶粉, 20ML洗膜液.

洗膜液: 10*PBS 50ML, 450ML ddH2O, 0.5ML TWEEN-20

抗體孵育：

將膜上的封閉液洗去（輕輕晃晃就可）

一抗:用雜交液配置.濃度可根據(jù)點(diǎn)蛋白實(shí)驗(yàn),及ECL要求來定.

4度,過.有那種4度搖床.我一般早上到實(shí)驗(yàn)室后,再搖床上再搖3個(gè)小時(shí)左右.

洗膜液洗3次,每次10分鐘.

二抗: 用雜交液配置.室溫,搖床,1小時(shí).

洗膜液洗3次,每次10分鐘.PBS洗5分鐘.

如果一抗沒有混濁,放置時(shí)間不長,可以重復(fù)使用,本人一般連作二天時(shí),才會(huì)重復(fù)用,如果因?yàn)橐豢沟脑蚨怀鼋Y(jié)果,太不值了.

雜交液: BSA0.5克, 洗膜液50ML.4度保存,如有混濁,重配.

點(diǎn)蛋白試驗(yàn):

在正式作WESTERN之前可先做這個(gè),如果沒有結(jié)果可能提蛋白中不含目的蛋白,也可能一抗與目的蛋白結(jié)合不好,或一,二抗結(jié)合不好.（之前拿一滴二抗和ECL試一下是否發(fā)光,以排除二抗的問題）.若有結(jié)果,可能選擇一個(gè)比較合適的一,二抗?jié)舛?/span>.

取小塊膜,放到24孔板中（PVDF先有甲醇泡,烘干）,滴上不同濃度的蛋白（先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干）,加封閉液,室溫,搖床一小時(shí), 洗去. 加不同濃度一抗,2-3小時(shí), 室溫,搖床.洗膜液洗3次,每次10分鐘.不同濃度二抗一小時(shí), 室溫,搖床. 洗膜液洗3次,每次10分鐘.PBS洗5分鐘.顯色

ECL顯影

將膜上多余的水吸干,與膠相鄰的一面向上,按ECL說明書配置發(fā)光液.點(diǎn)在膜上.

不同廠家ECL要求不一樣,本人用的ECL二種液體1:1混合后,0.125/CM2, 放置2分鐘,吸干（可以用微量加樣器抽回來,可連續(xù)用下一張膜）,放在保鮮膜上,包好,壓片.

若肉眼可見發(fā)光,可壓10-20秒; 若看不到,可壓30分鐘.（再長的時(shí)間沒試過,一般30分鐘不出,就重新再回一次ECL,重做一次,若再不出,就認(rèn)為沒有了.）

轉(zhuǎn)完膜后的膜如果不能及時(shí)做,可放在洗膜液中,4度保存,zui多放過2天,時(shí)間長了就不知道了.

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