士鋒生物感受態(tài)細(xì)胞制作方法

最近更新時(shí)間：2013-10-11

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相關(guān)產(chǎn)品：

法一

A液：1M，MnCl2：

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌;

C液 稱取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液（46ml）中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混勻冰浴即可使用。

劃線得到單菌落,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時(shí)， 挑取2-4個(gè)形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養(yǎng)基的三角瓶,37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養(yǎng)3-4小時(shí), 將培養(yǎng)溫度調(diào)至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養(yǎng)，其余與普通感受態(tài)差不多，每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280ml DMSO（可用國產(chǎn)分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時(shí)以上。取出感受態(tài)放入-70℃超低溫冰箱備用。

效率非常高，一般可到10*8，好時(shí)可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化。

潔凈是zui重要的。無菌都無所謂，在操作臺(tái)上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g 5min。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復(fù)，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時(shí)以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會(huì)減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。

預(yù)冷是必要的。整個(gè)過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時(shí)經(jīng)常在室溫倒置1min，對(duì)感受態(tài)效率提高有幫助，*次多加一點(diǎn)緩沖液，我經(jīng)常加至20ml，效果不錯(cuò)。

關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，zui復(fù)雜的莫過于電轉(zhuǎn)化，而zui簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉(zhuǎn)化。對(duì)于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。

現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率zui高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化，可達(dá)到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率，的莫過于1990年《GENE》上刊登的由Inoue H.等提出的感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方，其中有一些對(duì)普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。

1、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的，毋庸置疑。

2、培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關(guān)系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。

3、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測(cè)一下pH值，不要低于6.0，在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。

4、培養(yǎng)后的OD值。其實(shí)這并一個(gè)非常重要的參數(shù)，只是當(dāng)OD值大到一定的程度后，菌體要保持對(duì)數(shù)生長已經(jīng)不太可能，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6，0.8等等。同時(shí)，OD值大時(shí)菌體總量大，因而感受態(tài)數(shù)量要大一點(diǎn)，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。

5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2 離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí)，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會(huì)收到很好的效果。

6、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用，因而產(chǎn)生了Inoue的感受態(tài)制備方法，它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。

7、此外文獻(xiàn)報(bào)道，在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比甘油的效果要好，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。

8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時(shí)以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱，這點(diǎn)未做實(shí)驗(yàn)，只是一種感覺，*次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。

方法二

1.液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度過至長出單菌落.

2.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個(gè), 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基量不可再多,會(huì)影響效率.

3.在18度 150-250RPM 培養(yǎng)19-50小時(shí)*沒有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高于37度.

4.OD600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng), 放在冰水中冷卻10分鐘

5. 4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體

6.去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘

7.再次離心回收菌體

8.用1/12.5體積的TB懸浮, 添加zui終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘

9.0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上.

10.在液氮或-80度保存.

【zihudie】

（1）將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養(yǎng)活化。

（2）挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基，18℃，200-250rpm培養(yǎng)。

（3）當(dāng)OD600=0.5-0.8時(shí)，用預(yù)冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。

（4）用預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。

（5）重復(fù)第4步操作。

（6）用8mL預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% 。

（7）冰浴10min后，分裝保存于液氮中。

本法效率*,建議大家采納

【yog】

1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM過------1%轉(zhuǎn)接-------37度 200RPM2小時(shí)（OD到0.4~0.5）

2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min

3. 4度, 6000RPM 10min, 重懸浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min

建議用TSS法，簡單方便，比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高.別的菌可能不一定適用。

以下為轉(zhuǎn)貼，具體方法請(qǐng)查閱文獻(xiàn)。

E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法:

單菌落平板至2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 轉(zhuǎn)至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600

=0.2-0.4

離心后用10毫升TSS重懸后,分裝 -70oC保存。盡量冰上操作.

轉(zhuǎn)化: 加質(zhì)粒（<5 ul/100ul cell） 后冰上30分鐘，42℃ 90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml

, 37℃ 1小時(shí)后鋪抗生素平板。

TSS:

7.0ml pH6.1 LB

2.0ml 50% PEG6000

0.5ML dmso

0.2ML Mg2 （0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4）

0.3ml ddH2O

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